基质金属蛋白酶-2/9敏感型可跨膜融合抗氧化酶的表达、纯化和表征

融合了跨膜肽的抗氧化酶可进入细胞,保护细胞免受放射损伤。然而跨膜肽的跨膜能力没有靶向性,其也可把抗氧化酶带入肿瘤细胞进而保护肿瘤细胞,降低放疗的效果。为此,根据多数肿瘤细胞微环境中存在活性基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2或MMP-9的特点,在细胞跨膜肽R9与人铜、锌超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 1,SOD1)和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)之间融合MMP-2/9的底物肽X,设计了融合蛋白GST-SOD1-X-R9。该蛋白在肿瘤微环境中可因MMP-2/9酶切底物肽X而失去跨膜肽,从而无法进入肿瘤细胞,进而只能进入正常细胞。全基因合成SOD1-X-R9序列,并将其插入原核表达载体pGEX-4T-1中,得到表达质粒,并实现了GST-SOD1-X-R9融合蛋白的可溶表达。GST-SOD1-X-R9经硫酸铵沉淀和GST亲和层析纯化,分子量约为47 kDa,与理论值一致。纯化的融合蛋白的SOD活性和GST活性分别为2954 U/mg和328 U/mg。GST-SOD1-X-R9的SOD活性或GST活性在生理条件下几乎没有变化。该融合蛋白在溶液中可被胶原酶Ⅳ部分水解。分别建立了2D和3D培养的HepG2细胞模型来检验肿瘤微环境中的MMP-2活力对该蛋白跨膜能力的影响。在2D培养模型中,HepG2的MMP-2活力极低,但在3D培养模型中,随着培养时间的增加,HepG2肿瘤球的体积变大,其胞外MMP-2活力也随之增强。GST-SOD1-X-R9在2D培养的HepG2细胞中具有和GST-SOD1-R9蛋白一样的跨膜效率,但在3D培养的HepG2细胞球中的跨膜能力大大降低。本研究为后续深入研究GST-SOD1-X-R9靶向防护正常细胞的氧化损伤效应奠定了基础。

当归生药中两种PR-10蛋白亚型的纯化与表征

为了进一步研究当归(Angelicasinensis)生药中的蛋白质及其功能,通过80%硫酸铵沉淀、Sephadex G-50凝胶过滤层析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析,首次从当归生药中纯化出两种分子量相近的蛋白(命名为ASPR-C-1和ASPR-C-2)。ASPR-C-1和ASPR-C-2在SDS-PAGE上的分子量分别为17.33 kDa和17.18 kDa,在溶液中主要以单体形式存在,但会部分形成二聚体,二者均为糖蛋白,糖基含量分别为2.6%和8.2%。经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF?)鉴定发现ASPR-C-1和ASPR-C-2均为病程相关(Pathogenesis-related 10,PR-10)家族蛋白,且具有核糖核酸酶活性,比活分别为73.60 U/mg和146.76 U/mg。两种蛋白的最适pH相近,均为5.6左右,但最适温度不同,ASPR-C-1的为50℃,ASPR-C-2的为60℃。二者虽然在60℃下都表现出最大的酶活力稳定性,但在更高的处理温度(80–100℃)下,ASPR-C-1迅速失活,最终仅余20%左右活力,ASPR-C-2则表现出良好的热稳定性,最终仍有80%左右活力。此外,Fe^(2+)对二者的酶活性具有激活作用,而Ca^(2+)、Mg^(2+)、Zn^(2+)、Mn^(2+)、Ag^+、Cu^(2+)、EDTA、DTT和SDS则会不同程度地抑制二者的酶活性。研究结果为深入研究来自当归生药的PR-10蛋白的生物学功能奠定了基础。