丝状真菌启动子研究进展

文中综述了丝状真菌中用于开启异源或同源基因表达的启动子的最新进展。分别重点介绍了在丝状真菌中诱导型启动子、组成型启动子及其他一些启动子的应用情况,为在丝状真菌中表达异源基因或一些新基因功能的研究提供帮助。

辅酶Q_(10)菌种选育及高通量筛选研究进展

辅酶Q10在预防和治疗人体疾病上起到非常重要的作用,广泛应用于化妆品和保健品领域,其市场需求和工业产量均持续扩大。微生物发酵法制备辅酶Q10是目前最经济且有前景的方法,而选育获得高产菌株是微生物发酵生产的关键。通常,采用传统或现代遗传改造技术处理菌株,产生大量突变后代,然后从中筛选出增幅最大的高产菌株。由于微生物突变是随机不定向的,因此高通量的筛选技术是实现突变库快速高效筛选和提高育种效率的保障。综述了近年来国内外在辅酶Q10高产菌株选育方面的技术和原理进展,以及显色定量法、紫外薄层色谱、HPLC,UPLC等技术在其高通量筛选方面的应用等相关研究进展。

多不饱和脂肪酸合成途径研究进展

多不饱和脂肪酸在大多数生物体膜生物学和信号传递过程中起着至关重要的作用。最近研究发现,一些深海生物合成多不饱和脂肪酸并非由饱和脂肪酸的延长及脱饱和反应,而是由聚酮合酶途径(polyketide synthase,PKS)直接合成。介绍多不饱和脂肪酸的生物合成并总结近年来聚酮合酶这一新途径及其分子机制的研究进展。

超声波破碎辅酶Q_(10)工艺研究

通过单因素试验和正交试验对超声波提取辅酶Q10的工艺条件进行了优化,确定了类球红细菌辅酶Q10的最佳提取条件为:输出功率为55%、每次辐射时间为3s、工作总时间为6min、菌液浓度OD为23.4,条件优化后辅酶Q10单位细胞产量达到11.86mg/L。

培养基组分对细脚拟青霉液体发酵生物量与有机粗提物量的影响

研究通过正交试验考察细脚拟青霉液体发酵培养基3种主要组分马铃薯、葡萄糖和蛋白胨对其生物量与发酵液有机粗提物量的影响。结果表明,培养基成分为400g/L的土豆,11g/L的蛋白胨和40g/L的葡萄糖时,细脚拟青霉菌丝体生长较佳,其菌体生物量可达30g/L;培养基成分为200g/L的土豆,8g/L的蛋白胨及40g/L的葡萄糖时,其发酵液有机粗提物量较高,可达36mg/L。

表达淀粉酶、糖化酶葡糖酸醋杆菌工程菌的构建

采用基因融合技术,将葡糖酸醋杆菌Gluconacetobacter hansenii ATCC23769分泌蛋白CMCax的信号肽序列分别与来源于枯草芽胞杆菌的淀粉酶基因、黑曲霉的糖化酶基因融合构建融合蛋白,连入能在G.hansenii ATCC23769自主复制的载体pbs-H1S中,电击转入G.hansenii ATCC23769,构建能内源表达淀粉酶、糖化酶,以及淀粉酶-糖化酶的葡糖酸醋杆菌。淀粉平板透明圈检测结果和DNS测酶活结果显示,构建的3种工程菌能成功表达并分泌淀粉酶和糖化酶。

类球红细菌产辅酶Q_(10)发酵工艺的优化

类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)是一类高产辅酶Q10的光合细菌,该研究对R.sphaeroides EIM-8产辅酶Q10的发酵条件和培养基进行了优化。采用单因素结合响应面设计优化后的培养基组成为:葡萄糖27.8 g/L、(NH4)2SO4 4.9 g/L、谷氨酸4.7 g/L、玉米浆粉2.5 g/L、MgSO49.5 g/L、FeSO41.5 g/L,NaCl 3.5 g/L,KH2PO44.0 g/L、辅液15.0 mL/L;通过单因素试验方法确定的培养条件为:pH 6.5、温度32℃、接种量10%、装液量40mL/250 mL,此条件下辅酶Q10产量可达128.9 mg/L,比优化前提高了89.0%。

内切中性纤维素酶EGⅡ的发酵条件优化

对毕赤酵母基因工程菌EIM-50-eg2产内切中性纤维素酶的主要影响因子进行研究,考察氮源、pH、温度、微量元素PTM1和甲醇浓度等对工程菌产酶的影响。单因素实验和正交实验结果表明,优化后的培养基组成及培养条件:磷酸氢二铵40 g/L,甲醇15 mL/L,硫酸镁10 g/L,磷酸二氢钾9 g/L,初始pH 6.0,培养温度28℃,PTM1添加量0.02%,甲醇诱导浓度1.5%。优化后内切葡聚糖酶活力可达4 158 U/(mL.min)是优化前1 449 U/(mL.min)的2.86倍。

响应面法优化蛹虫草深层培养产菌丝及虫草素的发酵工艺

通过单因素试验和响应面设计对蛹虫草液体深层发酵工艺进行优化。结果显示,最适的碳氮源是葡萄糖和蛋白胨;培养的适宜条件:装液量100 mL,初始pH值5.0,发酵周期为8 d;对于虫草素产量影响最显著的无机盐是FeSO_4。Plackett-Burman设计从8个因子中筛选出4个显著因子,经最陡爬坡和响应面设计,结果表明,葡萄糖31.58 g/L,蛋白胨34.48 g/L,腺嘌呤0.88 g/L,甘氨酸15.48 g/L为发酵培养基的最佳组合;优化条件下,虫草素的产量为917.53 mg/L,生物量为30.06 g/L,较优化前分别提高了108.30%和29.06%。

酿酒酵母SNF4基因的克隆及生物信息学分析

SNF4基因编码的Snf4p具有调节Snf1复合体的蛋白激酶活性功能,根据已知的SNF4基因序列设计引物扩增获得S.cerevisiae YS2的SNF4基因完整序列。序列分析表明,SNF4基因的开放阅读框为969bp,编码322个氨基酸残基。应用生物信息方法预测其理化性质、疏水性、信号肽、亚细胞定位、活性位点及其高级结构。结果表明:Snf4p为具有一定亲水性的非跨膜胞内稳定酸性蛋白,功能结构域为CBS_pair superfamily结构域,二级结构主要由a-螺旋组成,空间结构是由4个CBS结构域构成两个CBS对围绕形成的二聚体。Snf4p的第一个CBS对区域的β片层结构是Snf1p、Sip2p的β发夹结构结合作用区。

黑曲霉EIM-6 pelA基因的克隆及生物信息学分析

目的:克隆黑曲霉EIM-6果胶裂解酶A基因pelA,用于分析果胶裂解酶A的功能与结构。方法与结果:根据GenBank上黑曲霉pelA保守序列设计引物,采用RT-PCR获得黑曲霉EIM-6pelA基因;序列分析表明,pelA基因具有4个内含子,开放读框为1140 bp,编码379个氨基酸残基,含有由20个氨基酸残基构成的信号肽序列;生物信息学分析表明,果胶裂解酶A为具有一定亲水性的稳定酸性分泌蛋白,具有明显的跨膜结构域,β片层结构是该蛋白的主体结构,空间结构是由反平行的β片层结构为基础包围组成的大环,保守功能区域为Pec_lyase_C结构域。结论:克隆获得黑曲霉EIM-6pelA基因,并进行了生物信息学分析,为蛋白质工程改造果胶裂解酶A奠定了基础。

黑曲霉果胶裂解酶的生物信息分析

用生物信息方法对果胶裂解酶(PNL)基因的核酸序列及其推导氨基酸序列的组成、亚细胞定位、疏水性/亲水性以及二、三级结构等进行分析。结果表明,黑曲霉的PNL为具有一定亲水性的稳定酸性分泌蛋白,具有明显的信号肽,无跨膜结构区,保守功能结构域为Pec_lyase_C。二级结构主要构成是不规则卷曲,具有以β片层结构为基础的相似三维空间结构。

微藻生产生物柴油的前景与挑战

介绍了微藻生产生物柴油的优势及研究进展,分析了微藻生物柴油产业所面临的问题,提出了微藻生物柴油产业发展战略意见:从藻种的选育和培养,到收获、油脂的提取、酯交换的每一步都要降低成本,从生产过程中取得高附加值的产品,最大程度提高利润,并对微藻生物柴油应用前景进行了展望。

灰黄霉素高产菌F208发酵过程蛋白质表达差异的研究

目的为探寻灰黄霉素生物合成过程中的关键酶,以蛋白质组学技术手段分析灰黄霉素高产菌F208发酵过程蛋白质表达差异。方法通过双向电泳联用质谱技术对F208发酵过程蛋白质组图谱进行比较分析。结果研究发现灰黄霉素产生期(192 h)F208表达的蛋白质与产生前期(72 h)有较大差异,并鉴定出在灰黄霉素产生高峰期蛋白表达量明显增加的两个特异点是丝氨酸羟甲基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸合成酶。结论成功建立灰黄青霉菌丝体总蛋白双向电泳技术体系。并鉴定出两个蛋白特异点,极可能与灰黄霉素生物合成有关。

黑曲霉原生质体诱变选育果胶酶高产菌株

通过UV和NTG诱变筛选获得了2株高产果胶酶突变株。以果胶酶产生菌黑曲霉EIM6为诱变材料,采用1.5%的溶壁酶和1.5%的纤维素酶处理其对数生长期菌丝体2 h获得高质量的原生质体。采用UV25S或50μg/mL NTG诱变30 min,构建原生质体突变库,经刚果红果胶平板筛选获得果胶酶突变株,通过液体深层培养复筛获得高产突变株EIM6-U11、EIM6-N5,酶活力分别从46 598.08、46 598.08 U/mL提高至68 596.57、68 879.56 U/mL,分别提高了47.21%、47.82%。连续8次传代经发酵测酶活力表明高产突变株EIM6-U11、EIM6-N5具有较高的遗传稳定性。

宏基因组学在发现新基因方面的应用

现代分子微生物生态学研究表明,自然环境中约99%的微生物不能用传统的分离培养方法获得其纯培养,使得环境微生物中的多样性基因资源难以得到充分的开发和应用。宏基因组学是近年来发展起来的,通过直接提取特定环境中全部微生物的总基因组DNA并克隆到合适的可培养微生物宿主中,来筛选目的基因的方法。它已在微生物新功能基因筛选、活性物质开发和微生物多样性研究等方面取得了显著成果。该文旨在介绍宏基因组学在新功能基因发现方面的应用概况并结合我们的研究情况,对这一崭新领域中的最近研究进展进行简要综述。

中性纤维素酶外切葡聚糖酶CBHⅡ的异源表达

利用聚合酶链式反应(PCR)技术,从本实验室保存的1株特异腐质霉EIM-50上克隆到中性纤维素酶外切葡聚糖酶基因(CBHⅡ)全长序列,大小约为1 586 bp。将其克隆到pPIC9K上,成功构建重组质粒pPIC9K-CBHⅡ,并经电转化引入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,进行异源表达。SDS-PAGE银染结果表明,该重组质粒在毕赤酵母中获得了异源表达。gel pro Analyser软件分析其表达蛋白的表观分子量约为62.548ku。用BandScan软件分析其蛋白表达量为2.3%,即0.738μg/mL(mg/L)。

中华被毛孢的液体培养条件优化

[目的]优化中华被毛孢的液体培养条件。[方法]通过18srDNA及系统进化树对中华被毛孢进行鉴定分析,然后以中华被毛孢菌丝体生物量为指标,采用单因素试验和正交试验研究菌丝体液深层发酵的培养条件。[结果]单因素试验表明,最佳的氮源为蛋白胨,其次为牛肉膏;最佳碳源为葡萄糖,其次为蔗糖和麦芽糖。正交设计试验表明,菌株的液体发酵的最佳配方:浓度1%葡萄糖+浓度0.5%蛋白胨+浓度0.1%酵母粉+浓度0.01%维生素B1+浓度0.05%KH2PO4+浓度0.05%MgSO4;在该浓度培养下,菌丝体生物量可达到20.8 g/L。[结论]该方法优化了中华被毛孢的液体培养条件,为中华被毛孢的的开发利用提供依据。

古尼拟青霉和中国被毛孢菌丝体氨基酸分析

古尼拟青霉和中国被毛孢分别是古尼虫草与冬虫夏草的无性型。将古尼拟青霉和中国被毛孢进行液体深层培养,测定并比较2种虫草菌丝体的氨基酸含量与组成。结果表明,中国被毛孢菌丝体与古尼拟青霉菌丝体的氨基酸总量差异不明显,但古尼拟青霉的人体必需氨基酸和芳香族氨基酸与中国被毛孢相比分别高出17.6%和25.4%,而中国被毛孢菌丝体的儿童必需氨基酸和胱氨酸的含量是古尼拟青霉的2倍多,二者的鲜味类氨基酸含量一致。以期为2种虫草保健食品的开发与质量标准制定具有一定参考价值。

侧孢短芽胞杆菌产生线虫侵染性蛋白酶的优化

采用单因素试验确定侧孢短芽胞杆菌G4产线虫侵染性蛋白酶的最佳碳氮源,通过Placket-Burman设计筛选影响蛋白酶活力的主效因子,最陡坡试验和Box-Behnken设计获得主效因子的最佳水平,建立线虫侵染性蛋白酶的最佳生产体系:葡萄糖9.78 g/L、牛肉膏16.65 g/L、磷酸氢二钾0.75 g/L、可溶性淀粉12.5 g/L、氯化钠0.75 g/L、硫酸镁0.5 g/L、初始pH值自然、装液量50 mL,37℃摇瓶培养32 h,蛋白酶活力可达12 379.41 U/mL,较优化前的2 476.3 U/mL提高了4倍。