海洋微生物来源的肿瘤细胞抑制剂rakicidin B在乏氧条件下的作用机制初探

探索海洋微生物来源的rakicidin B在乏氧条件下对人结肠癌细胞系HCT-8细胞的作用机制。本研究采用克隆形成实验、划痕法和Transwell法测定rakicidin B对乏氧条件下HCT-8细胞克隆形成能力、细胞迁移与侵袭的影响;以实时荧光定量RTPCR和Westernblot检测HCT-8细胞株内HIFs关键基因(HIF1α、HIF2α)以及下游调控因子(VEGF、GLUT1、ABCG2、OCT4)转录水平及蛋白表达情况。实验结果表明:在乏氧条件下,rakicidin B可以抑制HCT-8细胞的克隆形成以及迁移与侵袭;同时,rakicidin B可以显著下调缺氧诱导因子以及相关蛋白的转录与表达水平。初步揭示rakicidn B在乏氧条件下抑制肿瘤细胞HCT-8增殖的分子机制是通过HIF1α和HIF2α信号通路调节下游相关基因转录与表达的结果。

枇杷酵素发酵过程生物学特性和主要功效酶活性研究

为探究枇杷酵素发酵过程生物学特性和主要功效酶活性变化规律,以枇杷为原料,分析发酵过程中有效活菌数、总酸、pH值、有机酸、总酚、氨基酸以及主要功效酶等代谢产物的变化。结果表明:在发酵过程中的有效活菌数在1~5 d内快速增长,达到10~9水平,20~140 d内保持在10~8数量级以上,有效维持稳定的微生物生态环境;pH值先降低后维持稳定在3.5左右,而总酸含量不断增加至6.26 g·L^(-1)后趋于稳定;总酚含量在1~65 d呈现上升趋势,65~140 d后缓慢下降;枇杷酵素含有17种氨基酸,含量较高的氨基酸主要是天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸,随着发酵时间增加,各氨基酸含量在不同阶段出现波动变化,总氨基酸含量与必需氨基酸含量逐渐提高。酵素中不同功效酶的活性变化规律较为复杂,蛋白酶活力在1~35 d呈逐渐上升趋势,酶活力最高至15.14 U·mL^(-1),在发酵35~65 d呈现缓慢下降趋势,65~140 d酸性蛋白酶活性趋于稳定;SOD酶活力在1~65 d阶段呈上升趋势,酶活力最高至42.0 U·mL^(-1),在发酵65~140 d呈现缓慢下降趋势;β-葡聚糖酶活性在1~20 d呈上升趋势,酶活力最高至4.52 U·mL^(-1),在发酵20~140 d β-葡聚糖酶活性趋于稳定;脂肪酶活力较低,在1~5 d呈上升趋势,第5 d取得最大值,最大值为0.12 U·mL^(-1),随着发酵时间延长脂肪酶活性逐渐降低。以上研究结果可为枇杷酵素的中试制备、品质优化及构建枇杷酵素的综合评价体系提供一定的依据。

雷帕霉素新衍生物FIM-X7通过促进自噬影响N2a-APP695细胞表达β淀粉样蛋白的研究

目的mTOR信号通路在Aβ诱导的神经退行性病变中起重要作用,mTOR抑制剂雷帕霉素具有潜在治疗作用。研究含噻唑侧链的雷帕霉素新衍生物FIM-X7对N2a-APP695细胞表达Aβ的影响,探讨FIM-X7在阿尔茨海默症的应用前景。方法ELISA方法检测FIM-X7对N2a-APP695细胞表达Aβ40和Aβ42的影响,Western-blot检测FIM-X7对N2a-APP695细胞表达自噬相关蛋白和mTOR信号通路的影响,淋巴细胞转化实验测定FIM-X7的免疫抑制活性,MTT法检测FIM-X7对N2a-APP695细胞增殖的影响,流式细胞术分析FIM-X7对N2a-APP695细胞凋亡的作用。结果FIM-X7通过抑制mTOR信号通路、降低自噬相关蛋白ULK1的磷酸化,促进细胞自噬进而降低N2a-APP695表达Aβ的水平;其对N2a-APP695细胞内Aβ40和Aβ42的作用效果与雷帕霉素相当。此外,FIM-X7几乎没有细胞毒性,对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的抑制活性仅为雷帕霉素的1/5000。结论雷帕霉素新衍生物FIM-X7具有降低N2a-APP695细胞表达Aβ40和Aβ42的作用,且具有比雷帕霉素更低的细胞毒性和免疫抑制活性,因此可能在阿尔茨海默症的治疗上具有进一步研究的价值。

氨基糖苷类药物生物合成基因研究新进展

近年来,有关氨基糖苷类药物生物合成的研究进展显著。利用放射性同位素,酶反应分析,蛋白质重组以及基因分析等技术,陆续了解了许多氨基糖苷类药物生物合成基因簇。在本文中,利用新霉素、布替罗星的生物合成途径中的相关酶功能与遗传信息的关系,我们对有关2-脱氧链霉胺(2DOS)氨基糖苷类抗生素(如卡那霉素、庆大霉素等)的生物合成基因的研究进展做了综述。对未知功能酶的研究将使我们更好地掌握这类药物复杂的生物合成机制。

一株链霉菌的鉴定及其产格尔德霉素的发酵工艺研究

【目的】对链霉菌Streptomyce sp.FIM18-0592进行菌种鉴定,并对其胞外格尔德霉素产量进行发酵工艺优化,旨在提高产量并降低发酵成本。【方法】通过形态特征、培养特征和生理生化特性,结合16S rDNA序列分析构建系统发育树进行菌种鉴定;采用单因素试验优化培养条件及培养基配方,进一步使用最陡爬坡试验和响应面试验优化培养基配方的含量。【结果】通过对链霉菌FIM18-0592的形态特征、培养特征及生理生化特征进行初步培养观察发现,其在ISP2等培养基上生长较好,气生菌丝旺盛,产黑色素。结合16S rDNA分子鉴定,确定该菌为格尔德霉素链霉菌(Streptomyces geldanamycininus)。通过单因素试验对发酵条件以及培养基配方进行优化,得到最适宜菌株发酵的培养条件为转速140 r/min、装液量12%(体积分数)、接种量7%(体积分数)、培养时间144 h。最佳的碳源、氮源、无机盐分别为葡萄糖、黄豆饼粉和硫酸铵。采用最陡爬坡试验和响应面优化试验确定了其最优的发酵培养基为:葡萄糖10.42%、黄豆饼粉1.68%、硫酸铵0.3%、乳酸0.3%、甘油4%、硫酸镁0.1%、碳酸钙0.4%,在此条件下,格尔德霉素的发酵效价达到2887μg/mL,较原始发酵工艺效价提高了66%。【结论】链霉菌FIM18-0592为格尔德霉素链霉菌,通过对其发酵工艺进行优化显著提高格尔德霉素的产量,为格尔德霉素及其衍生物的开发和利用奠定基础。

小单孢菌FIM10-2207生物转化卡那霉素B的初步研究

在卡那霉素B的微生物转化研究中,从台湾海峡海底沉积物中分离得到五株对卡那霉素B具有转化作用的菌株,选取其中转化率较高的一株菌,编号为FIM10-2207,经分类学研究鉴定为小单孢菌。初步考察了培养基的选择,底物卡那霉素B的初始浓度和添加时间这3个因素对转化率的影响,发现转化培养基C,添加时间32h和底物初始浓度1500μg/mL时,转化率较高。卡那霉素B经该菌株转化后,得到一个新化合物,波谱数据分析结果表明该产物为1,3″-二乙酰化卡那霉素B。

两株好氧反硝化聚磷菌的筛选、鉴定及水质净化研究

旨在从环境样品中筛选对富营养化水体具有良好脱氮除磷效果的好氧反硝化菌。采集福州某养猪场污水处理池中的水样。通过反硝化细菌培养基培养、BTB培养基平板分离、硝酸盐还原试验和蓝白斑筛选法、异染颗粒以及聚-β-羟基丁酸(PHB)颗粒染色试验,筛选获得两株具有脱氮除磷特性的菌株,命名为N1和N2。经16S r RNA基因序列分析,N1和N2分别属于无色杆菌属(Achromobacter.sp)和短波单胞菌属(Brevundimonas.sp)。将菌株N1和N2复配,获得脱氮除磷复合菌FIM-1。考察了菌株对人工合成污水和富营养化水体脱氮除磷的效果。结果表明,两株菌在含磷量较低的水体中,对磷的去除率较高,相对于单菌,复合菌表现出更佳的脱氮除磷效果。

福建古田红曲生产用红曲霉菌主要种类的鉴别

以购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)的5株红曲霉菌为对照,对福建省微生物研究所红曲霉菌资源库中收藏自福建省古田县的60株红曲霉菌(Monascus sp.)进行分类鉴定研究。首先根据不同菌株在麦芽汁琼脂(Wa)、察氏酵母提取物琼脂(CYA)和甘油硝酸盐琼脂(G25N)培养基上的菌落形态特征进行初步分类,进而基于核糖体DNA内转录间隔区(rDNA internal transcribed spacer,rDNA ITS)、核糖体大亚基(28S nuclear ribosomal large subunit rRNA gene,LSU)和核糖体小亚基(18S nuclear ribosomal small subunit r RNA gene,SSU)的基因片段的测序结果,在Gen Bank中通过BLAST进行分子生物学方面的鉴定研究,并用ITS序列构建系统发育树。通过形态特征及3个基因序列的比对,认为所选取的60株古田红曲霉菌分别归属红色红曲霉菌(M.ruber)、丛毛红曲霉菌(M.pilosus)或紫色红曲霉菌(M.purpureus)3个种。

一种浸矿混合菌种的筛选、鉴定及浸矿的研究

旨在从某低品位硫化铜矿酸性矿坑水中分离获得浸矿效果优良的细菌,同时对细菌的浸矿行为进行初步的研究。采集福建某低品位硫化铜矿酸性矿坑水样品,9K培养基富集获得混合菌种FIM-201304。利用9K固体平板,从混合菌FIM-201304中分离获得优势浸矿菌D-1。应用高通量Illumina Miseq测序技术分析混合菌FIM-201304的群落结构。通过表型特征和16S rRNA基因序列分析鉴定菌株D-1。采用摇瓶培养对比研究混合菌和单菌对低品位硫化铜矿和低品位硫化镍矿的浸出效果。结果显示,高通量测序技术分析结果表明,混合菌FIM-201304的优势菌是嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,A.f errooxidans)(丰度占比85.02%)、铜绿色假单胞菌(Pseudomonas sp.)(丰度占比10.07%)、嗜酸异养菌(Acidiphilium acidophilum,A.acidophilum)(丰度占比1.30%)和鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)(丰度占比1.21%)。表型特征和16S r RNA基因序列分析确定菌株D-1属于氧化亚铁硫杆菌。摇瓶实验结果表明,浸出反应20 d后,接种混合菌的浸出体系中铜、镍浸出率分别为65%和56%,相同条件下,接种单菌的浸出体系中铜、镍的浸出率为41%和36%,接种混合菌的浸出体系比接种单菌的浸出体系中铜、镍浸出率分别提高了24%和20%。混合菌对矿石的浸出效果显著优于单菌。异养菌促进了自养菌对矿石中金属元素的浸出。

大环内酯类化合物产生菌的基因筛选及其代谢产物研究

应用Ⅰ型聚酮合酶(PKS-I)基因筛选体系从32株海洋放线菌中寻找大环内酯类化合物的潜在产生菌,通过DNA序列相似性比对从5株阳性菌株中筛选获得了游动放线菌Actinoplanes sp.FIM060065。采用HPLC制备色谱从该菌株发酵液中分离纯化得到一个大环内酯类化合物FW060065,紫外、质谱以及核磁共振波谱分析表明它与台勾霉素B同质,药敏实验表明其对艰难梭菌、消化链球菌、双歧杆菌等革兰氏阳性厌氧菌显示出较强的抗菌能力。本研究通过基因筛选获得了台勾霉素的产生菌及其相应的代谢产物,为Ⅰ型聚酮合酶基因与大环内酯类化合物之间的联系提供了证据。

基于深孔板培养高通量筛选rakicidin B1高产菌的研究

目的获得rakicidin B1的高产突变菌株。方法建立深孔板发酵rakicidin B1的方法,结合常压室温等离子体技术(ARTP)及核糖体工程对rakicidin B1的产生菌进行高通量诱变选育。结果获得一株高产突变菌株R36-27,其摇瓶发酵产量达到490mg/L左右,较出发菌株提高了237.9%;经遗传稳定性考察验证了该菌株稳定性较好。结论采用ARTP为诱变源,以庆大霉素抗性为选择压力,结合深孔板高通量筛选,可以快速有效地获得高产菌株。

聚酮合酶与药物筛选的研究进展

由于结构多样化和生物活性多样性,聚酮化合物已经成为新药的重要来源。聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)是合成聚酮类物质的酶复合体。本文介绍了聚酮合酶的分类、作用机制及相关药物筛选的研究进展。并对通过宏基因组技术,从自然环境中获得新聚酮化合物的基因筛选方法的研究进展进行了总结。

子囊霉素产生菌营养生物合成和化学合成限定培养基的建立

目的建立新型免疫抑制剂子囊霉素产生菌吸水链霉菌FAC0329的化学合成限定培养基,为进一步研究子囊霉素产生菌的营养生物合成奠定基础。方法分别试验不同浓度的20种碳源,19种氨基酸和7种无机盐对子囊霉素产生菌FAC0329生长和子囊霉素生物合成的影响,应用建立的子囊霉素合成培养基研究了子囊霉素、FK506和雷帕霉素三个结构类似物的生物合成,表明该培养基的专一性。结果与结论研究了子囊霉素的营养生物合成,首次建立了适合子囊霉素产生菌的专一化学合成限定培养基,为进一步研究子囊霉素的生物合成,提高发酵生物效价提供必要条件。

芳香聚酮类化合物产生菌的分子筛选及其代谢产物的研究

目的建立一种芳香聚酮类化合物产生菌的基因筛选方法并获得相应结构类型的化合物。方法依据芳香聚酮类化合物生物合成途径所用的II型酮基合酶的同源性设计简并引物,通过PCR方法扩增出约0.6kb目的基因片段,同时通过同源进化和抗菌活性分析对海洋放线菌是否产生芳香聚酮类化合物进行早期评估,并最终从阳性菌中分离得到相应结构类型的化合物。结果利用建立的芳香聚酮类化合物产生菌基因筛选体系对100株海洋放线菌进行筛选,获得了18株携带II型酮基合酶基因的阳性菌株,通过同源进化和抗菌活性分析后从中筛选到1株与多环氧杂蒽酮类化合物lysolipin和xantholipin的酮基合酶基因同源的野野村菌(Nonomuraea sp.)FIM02-765,并最终从该菌中分离得到多环氧杂蒽酮类化合物simaomicinα。结论本研究通过聚酮合酶编码基因的同源进化分析以及建立起来的II型酮基合酶基因与化合物之间的联系,验证了芳香聚酮类化合物产生菌的基因筛选方法的可行性,同时本文还首次从野野村菌(Nonomuraea sp.)中分离得到多环氧杂蒽酮类化合物simaomicinα,这些都为高效利用海洋放线菌资源和基因资源奠定了一定的基础。

西罗莫司F904及其衍生物FIM-A(AP23573)的体外抗癌活性

采用SRB和MTT法检测国产西罗莫司(西罗莫司F904)及其衍生物FIM-A的体外抗癌活性.结果表明,西罗莫司F904对白血病细胞株HL-60、胃癌细胞株MKN-45、肺癌细胞株A549、卵巢癌细胞株Ho-8910及乳腺癌细胞株MCF-7均具抑制能力,FIM-A对白血病细胞株HL-60、肺癌细胞株A549有抑制作用.

Rakicidin B1酯化衍生物的体外抗肿瘤和抗菌活性

目的本研究对rakicidin B1化合物3位羟基进行结构修饰,得到rakicidin B1酯化反应的系列衍生物,并考察其体外抗肿瘤及抗菌活性。方法以rakicidin B1为原料,经与不同的氯甲酸酯反应,再经水洗、制备、冻干制得目标化合物,其结构经~1H NMR,HR-ESI-MS确证。结果对酯化反应的4个衍生物进行体外抗肿瘤及抗菌活性测定,结果表明,化合物1~4对常氧和乏氧培养下的人结肠癌细胞HCT-8和人胰腺癌细胞PANC-1均具有较好的体外抑制作用;总体上看化合物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、艰难梭菌和万古霉素耐药粪肠球菌等10株革兰阳性菌活性均低于对照品,活性较弱。结论化合物1和3对人结肠癌细胞HCT-8和人胰腺癌细胞PANC-1具有较强的乏氧抗肿瘤活性,可作为新型的抗癌备选药物进行进一步研究。

抗艰难梭菌rakicidin B1新衍生物的设计、合成及生物学活性评价（英文）

目的以rakicidin B1为起始原料,经2步反应合成得到4个全新结构的rakicidin B1衍生物,并对其进行生物学活性研究,以期获得低细胞毒、高效抗艰难梭菌活性的化合物。方法课题组前期首次发现rakicidin B1具有较强的抗艰难梭菌活性,在其结构基础上进行修饰和优化,通过氨基甲酸酯连接基团引入含氮杂环,设计合成得到4个全新目标化合物。所有化合物结构经高分辩质谱和核磁确证,并经抗艰难梭菌活性测试和细胞毒性活性测试。结果在合成的4个化合物中,有3个化合物具有与先导化合物更强或相当的抗艰难梭菌活性;同时,MTT测试结果表明,3个化合物的细胞毒性降低,以3b的细胞毒性降低最多。结论通过对rakicidin B1母核结构进行修饰和优化,获得全新结构的rakicidin B1衍生物并对其进行抗菌和细胞毒活性筛选。其中,化合物3b保留潜在抗艰难梭菌活性且细胞毒性降低最多,作为全新结构类型的抗艰难梭菌活性化合物,有潜在的开发价值。

小分子前体物对巴弗洛霉素A1生物合成的影响

通过研究小分子前体物对巴弗洛霉素A1 生物合成的影响,寻找提高巴弗洛霉素A1 发酵产量的有效方法。主要考察了不同前体物对巴弗洛霉素A1 生物合成的影响,以及有效前体物的最佳添加浓度和添加时间点。结果显示,缬氨酸是巴弗洛霉素A1 合成的最佳前体,36 h 时添加0.2%缬氨酸,巴弗洛霉素A1 产量高达285.5 mg/L,比对照组提高了78.4%。前体物的供给能显著影响巴弗洛霉素A1 的生物合成,补加缬氨酸能有效提高巴弗洛霉素A1 的发酵产量。

实验室自动发酵罐系统的构建运行及维护

自动发酵罐在国内医药和食品发酵行业里的使用越来越普遍,构建运行一套理想的实验室自动发酵罐系统对于新产品的研发和实现产业化有着重要意义。本文借鉴国内外使用者的经验,结合发酵罐实例,对发酵罐系统的构建运行及维护进行初步探讨。

31-去甲氧基-他克莫司的突变生物合成

目的通过突变生物合成获得31-去甲氧基-他克莫司。方法针对大环内酯类免疫抑制剂他克莫司的聚酮链起始底物4,5-二羟基-1-烯-环己酸(DHCHC)合成酶fkbO基因,构建基因敲除载体pFIM412-fkbO并对他克莫司产生菌Streptomyces sp.FCZ-0311 fkbO基因进行框内缺失。结果获得突变株Streptomyces sp.OD14-1,经摇瓶发酵和产物HPLC分析,该突变株完全丧失了合成他克莫司的能力。在OD14-1摇瓶发酵36h后添加DHCHC类似物反式-4-羟基环己烷羧酸,发酵6d后经HPLC-MS检测发现分子量为773的他克莫司衍生物31-去甲氧基-他克莫司。结论构建了可用于他克莫司突变生物合成的基因工程菌Streptomyces sp.OD14-1,并通过外源物质的添加获得31-去甲氧基-他克莫司。