绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1 mRNA的表达研究

目的研究绝经后骨质疏松症肾阴虚证差异表达基因CLCF1、ASB1和PROK2的mRNA表达水平。方法随机选择绝经后骨质疏松症患者,中医辨证肾阴虚证组30例,27例健康绝经后妇女为对照组,RT-PCR法检测外周血CLCF1、ASB1和PROK2 mRNA的表达。结果肾阴虚组CLCF1 mRNA表达水平明显低于对照组(Z=-2.621,P=0.009);肾阴虚组ASB1mRNA表达与对照组比较,有降低趋势,但差异无统计学意义;与健康对照组比较,肾阴虚组PROK mRNA表达差异无统计学意义。结论骨质疏松症肾阴虚证与CLCF1 mRNA表达下调关联。

绝经后骨质疏松症肾阴虚证差异表达基因CLCF1蛋白表达研究

目的研究绝经后骨质疏松症肾阴虚证与CLCF1、ASB1和PROK2基因蛋白表达的相关性。方法病例对照方法,中医辨证肾阴虚证组29例,28例健康绝经后妇女为对照组,Western blot法检测外周血CLCF1、ASB1和PROK2蛋白表达水平。结果骨质疏松症肾阴虚组CLCF1蛋白表达水平(0.483±0.151)明显低于对照组(0.706±0.255),P=0.0001,统计学有非常显著性差异;肾阴虚组ASB1和PROK2蛋白表达与健康对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论骨质疏松症肾阴虚证CLCF1蛋白表达水平显著低于健康对照组,骨质疏松症肾阴虚证与CLCF1蛋白下调存在关联。

绝经后骨质疏松症肾阳虚证的关联基因LTBP1 mRNA的表达研究

目的研究绝经后骨质疏松症肾阳虚证的关联基因LTBP1及PCSK6的mRNA表达水平,探讨绝经后骨质疏松症肾阳虚证与LTBP1及PCSK6基因表达的关联性。方法随机选择绝经后骨质疏松症患者,中医辨证肾阳虚证组25例,32例健康绝经后妇女为对照组,RT-PCR法检测外周血LTBP1及PCSK6 mRNA的表达。结果肾阳虚证组LTBP1 mRNA表达水平低于健康对照组(F=7.473,P=0.008),差异有统计学意义;肾阳虚证组PCSK6 mRNA表达水平较健康对照组比较,有降低趋势,但差异无统计学意义;通过GO分析参与到的生物途径有细胞外组织形成、代谢过程、磷酸化作用、蛋白磷酸化、TGF-β的细胞外基质合成、BMP信号通路、细胞分泌等;通过Pathway分析参与到弹性纤维形成、细胞外基质组织、整合胰腺癌的通路、TGF-β信号通路、发育生物学、神经生长因子信号转导等通路相关。结论骨质疏松症肾阳虚证与LTBP1基因表达下调相关联。

hsa-miR-655靶向调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的实验研究

目的研究靶向调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的microRNAs。方法通过生物信息学预测可能与CLCF1基因3'非编码区(3'Non encoding area,3'UTR)作用的miRNAs;将人工合成的野生型和突变型CLCF1基因3'UTR区序列克隆至荧光素酶报告质粒;将重组荧光素酶报告载体和miRNAs表达载体共转染293T细胞,用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性,验证miRNA对CLCF1基因翻译水平的抑制作用。结果生物信息学预测结果显示,CLCF1基因3'UTR与hsa-miR-655、hsa-miR-300、hsa-miR-381、hsa-miR-374c、hsa-miR-515等5个miRNAs存在互补结合位点;双荧光素酶实验结果表明,与对照组比较,hsa-miR-655组荧光活性下调至33.09%,差异有显著性意义(P=0.001),当使用突变型CLCF1基因3'UTR,荧光活性上调至67.22%,说明hsa-miR-655对CLCF1 3'UTR的基因表达水平有显著抑制作用;与对照组比较,hsa-miR-374c和hsa-miR-515组荧光活性分别下调27.27%(P=0.000)和27.74%(P=0.006),二者对CLCF1 3'UTR的基因表达水平有一定抑制作用;hsa-miR-300和hsa-miR-381组与对照组相比,荧光活性分别下调6.35%(P=0.213)和9.89%(P=0.127),二者对CLCF1 3'UTR的基因表达无明显抑制作用。结论 hsa-miR-655通过靶向结合CLCF1 mRNA的3'UTR区,在转录后水平负性调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的表达。

绝经后妇女骨质疏松症肾阳虚证的关联蛋白LTBP1的表达及其cDNA测序的研究

目的探讨绝经后骨质疏松症肾阳虚证与LTBP1蛋白表达及cDNA变化的关联性。方法随机选择绝经后骨质疏松症患者,中医辨证肾阳虚证组27例,27例健康绝经后妇女为对照组,Western-blot法检测外周血LTBP1的蛋白表达,对cDNA片段进行测序。结果肾阳虚证组LTBP1蛋白表达水平(0.365±0.278)低于健康对照组(0.675±0.583)(P<0.05),差异有统计学意义。cDNA测序在健康对照组与肾阳虚证组中碱基无有意义的突变。结论绝经后骨质疏松症肾阳虚证与LTBP1蛋白表达下调相关联,测序发现与碱基突变无关。

绝经后骨质疏松症肾阴虚证的免疫蛋白相关研究

目的探讨绝经后骨质疏松症肾阴虚证与LRG1、SRC蛋白表达变化的关联性。方法随机选择绝经后骨质疏松症患者,中医辨证肾阴虚证组25例,30例健康绝经后妇女为对照组,Western-blot法检测外周血LRG1、SRC的蛋白表达。结果肾阴虚证组LRG1蛋白表达水平(1.2391±1.5860)高于对照组(0.8033±0.7485),有升高趋势,差异无统计学意义(Z=-0.085,P=0.933),肾阴虚证组SRC蛋白表达水平(0.7873±0.6275)与对照组(0.3712±0.4064)比较,差异有统计学意义(Z=-2.874,P=0.004)。结论骨质疏松症肾阴虚证与SRC蛋白表达升高相关联。

六味地黄丸对绝经后骨质疏松症肾阴虚证JAK/STAT信号通路基因的影响

目的通过观察六味地黄丸对绝经后骨质疏松症肾阴虚证JAK/STAT信号通路基因的影响,探讨六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症肾阴虚证的分子机制。方法随机选择绝经后骨质疏松症肾阴虚证组6例,健康绝经后妇女对照组3例。六味地黄丸治疗肾阴虚证组3个月后,用JAK/STAT信号通路芯片检测其基因表达的变化。结果治疗前肾阴虚证组与正常对照组相比,差异表达基因:PRLR、JUN、JUNB、INSR,表达均下调;肾阴虚证组治疗后与治疗前相比,差异表达基因有25条,上调11条,下调14条,其中JUN、JUNB疗后明显上调。差异表达基因生物学功能分析,免疫相关基因:PRL、PRLR、OSM、ISG15、IL4R;细胞生长增殖与细胞周期相关基因:F2、SOCS3;与STAT蛋白相互作用的转录因子和共同活化基因:JUN、JUNB、SMAD3、SMAD5、SMAD4、SP1、YY1;JAK/STAT信号通路的负反馈调节基因:PIAS1、SOCS4;衔接蛋白基因:SRC、STAM。结论六味地黄丸治疗绝经后骨质疏松症肾阴虚证的机制可能与其调控JAK/STAT信号通路的相关基因有关,这些基因的功能与免疫调节、细胞生长增殖及成骨生长关联。

六味地黄丸对绝经后骨质疏松症肾阴虚证差异表达基因的影响

目的探讨六味地黄丸对绝经后骨质疏松症肾阴虚证(POP)差异表达基因的影响。方法用基因芯片技术比较POP肾阴虚证组与POP肾阳虚证组、POP无肾虚证组、健康对照组受试者外周血基因表达谱,筛选出差异表达基因;六味地黄丸治疗POP肾阴虚证组3个月后,用基因芯片检测六味地黄丸对这些差异表达基因的影响。结果 1基因芯片筛选POP肾阴虚证组与其他3组比较均有显著性差异的差异表达基因:ASB1、CLCF1、PROK2、GPR27、C3orf35、GSTM5、MUC12,其中ASB1、CLCF1、PROK2、GPR27和C3orf35表达下调,GSTM5和MUC12表达上调。2六味地黄丸治疗POP肾阴虚证组3个月后,基因芯片检测ASB1、CLCF1的表达显著上调,CLCF1参与JAK-STAT信号通路中JAK1、CBP显著下调、STAT4显著上调,而PROK2、GPR27、C3orf35和GSTM5表达水平治疗前后比较无显著性差异。3六味地黄丸治疗POP肾阴虚证组3个月后,与治疗前相比,共有5701个差异表达基因,其中上调基因3072个,下调基因2629个。结论六味地黄丸上调POP肾阴虚证差异基因ASB1、CLCF1的表达,其治疗POP肾阴虚证的机理可能与其上调CLCF1介导JAK-STAT信号通路调控下游CBP表达有关。

miRNA在绝经后骨质疏松症肾阴虚证中的表达谱特征及生物信息学分析

目的探讨绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)肾阴虚证miRNA的表达谱特征,及对差异表达的miRNA进行生物信息学分析。方法随机选择绝经后骨质疏松症受试者,中医辨证,分为3组:PMOP肾阴虚组3例,PMOP肾阳虚组3例,健康绝经后妇女3例作为对照组。采用人miRNA芯片检测外周血单个核细胞miRNA的表达水平。肾阴虚证组分别与其他两组比较,筛选共同的差异表达基因,实时荧光定量PCR验证芯片结果,并对差异表达的miRNA进行pathway分析及靶基因预测。结果肾阴虚证组与对照组、肾阳虚证组两组比较,筛选出20条共同差异表达miRNA;实时定量PCR验证hsa-miR-411-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-95-3p表达的结果与芯片结果相符;pathway分析结果显示,这些差异miRNA主要参与代谢通路、癌症通路、Rap1信号通路、粘着斑信号通路、PI3K-Akt、MAPK信号通路、钙离子信号通路、内质网蛋白加工、c GMP-PKG信号通路、Ras信号通路、Wnt信号通路的调控;结合多个数据库对差异表达的miRNA进行靶基因预测,最终筛选出9个靶基因(RC3H1、SOX11、FUT4、GABRA4、NUFIP2、ONECUT2、PHF20、PURB、ZNF148)。结论建立了PMOP肾阴虚证的miRNA基因表达谱,且这20个差异表达的miRNA可能通过调控PI3K-Akt、MAPK、Wnt等与骨代谢相关信号通路参与PMOP肾阴虚证的发生发展过程。

lncRNA在绝经后骨质疏松症肾阴虚证中的表达特征及调控网络分析

目的探讨绝经后骨质疏松症肾阴虚证中lncRNAs的表达特征及基因调控网络。方法随机选择绝经后骨质疏松症受试者,分为肾阴虚证组3例和肾阳虚证组3例,并选择健康绝经后妇女3例为正常对照组,采用基因芯片技术检测外周血单个核细胞lncRNAs的表达水平。肾阴虚证组分别与其他2组比较,筛选共同差异表达lncRNAs,并构建lncRNA调控网络;实时荧光定量PCR检测LINC00334、LINC00189和LOC101929378的表达,验证基因芯片结果。结果肾阴虚证组与正常对照组和肾阳虚证组比较,筛选出8个共同差异表达lncRNAs:LINC00334、LINC00189、LOC101929378、XLOC_013921、ENSG00000237489.2、ENSG00000225278.2、AK125437和RNA95672;这些差异lncRNAs参与Jak/STAT、MAPK、胰岛素通路和钙离子代谢等12条信号转导通路的调控;实时荧光定量PCR证实,与正常对照组比较,LINC00189在绝经后骨质疏松症肾阴虚证表达下调(FC=4.71,P=0.007);LINC00334(FC=6.83,P=0.005)和LOC101929378绝经后骨质疏松症肾阴虚证表达上调(FC=4.51,P=0.035),变化趋势与芯片结果相一致。结论 LINC00334、LINC00189、LOC101929378、XLOC_013921、AK125437、ENSG00000237489.2、ENSG00000225278.2和RNA95672等8条lncRNAs可能通过调控Jak/STAT、MAPK、胰岛素通路和钙离子代谢等信号通路参与绝经后骨质疏松症肾阴虚证的发生发展过程。

长链非编码RNA GAS5在绝经后骨质疏松症肾阴虚证的表达及对骨免疫细胞因子的调控作用

目的研究长链非编码RNA GAS5(long non-coding RNA GAS5,lncRNA GAS5)在绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)肾阴虚证的表达及其对骨免疫相关细胞因子的调控作用。方法随机选择绝经后妇女,经骨密度检测和中医辨证分型,分为肾阴虚证组(38例)、肾阳虚证组(32例)和健康对照组(35名)。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测外周血单核细胞中lncRNA GAS5的表达。通过慢病毒介导的RNA干扰技术,抑制THP-1人单核细胞中lncRNA GAS5基因的表达,并应用细胞因子抗体芯片技术检测骨免疫相关细胞因子的表达变化。结果与对照组比较,lncRNA GAS5在PMOP肾阴虚证组和肾阳虚证组的表达水平均明显降低(P<0.01);与肾阳虚证组比较,肾阴虚证组lncRNA GAS5的降低趋势更明显(P<0.05);RNA干扰抑制lncRNA GAS5表达后,与对照组比较,干扰组lncRNA GAS5的表达下调67.58%,而白细胞介素(IL-6、IL-7、IL-17)、转化生长因子β(TGF-β1)、集落刺激因子(G-CSF、M-CSF)等23种骨代谢相关细胞因子的表达水平显著上调,重组人巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1b)、白细胞介素1 b(IL-1 b)、胞间黏附分子-1(ICAM-1)等3种因子的表达下调。结论lncRNA GAS5在PMOP肾阴虚证中低表达;体外抑制lncRNA GAS5的表达可影响骨免疫相关细胞因子水平。

网络药理学在中药治疗骨质疏松症中的应用

随着人类平均寿命的延长,骨质疏松症在老年人群中的发病率逐年升高,严重影响老年人的身心健康。传统中药历史悠久,药效确切且毒性较小,因此多用于治疗骨质疏松症。不过中药成分复杂,作用机制不明是一个巨大的挑战。新学科概念网络药理学的兴起正好解决了这个问题,将网络药理学的思想和方法应用于中药药理研究,在分子网络调控的背景下研究中药的作用机制已成为一种新的趋势,是进一步推动骨质疏松防治工作发展的主要途径。本文将就网络药理学在中药治疗骨质疏松症中的应用作一综述。

续苓健骨方对去卵巢骨质疏松模型大鼠血液钙磷代谢的影响

目的研究续苓健骨方对去卵巢骨质疏松模型大鼠骨密度、骨微结构和血液钙磷代谢的影响。方法将40只6月龄雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、续苓健骨方组[12.71 g/(kg·d)]和碳酸钙组[104.19 mg/(kg·d)],假手术组仅切除卵巢周围脂肪,其余组行双侧卵巢切除术后建立骨质疏松模型。药物干预12周后取材,通过双能X线骨密度仪检测左侧胫骨骨密度,经Masson染色观察右侧胫骨组织显微结构,生化检测血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、血钙和血磷水平。结果与假手术组相比,模型组骨密度显著降低,骨小梁断裂稀疏、排列不规则,TRAP表达增加,血钙含量降低,血磷含量升高。与模型组相比,续苓健骨方组骨密度增加,骨小梁数量增加、排列较规则,TRAP表达降低,血钙含量升高,血磷含量降低。结论续苓健骨方可提高去卵巢骨质疏松大鼠胫骨骨密度并改善骨组织微结构,其机制可能与调控血钙磷代谢稳态有关。

绝经后妇女骨质疏松症肾阴虚证与免疫关联基因LRG1、SRC mRNA表达的相关性

目的:探讨免疫关联基因富亮氨酸α2糖蛋白1(LRG1)及酪氨酸激酶蛋白(SRC)的mRNA表达水平与绝经后妇女骨质疏松症(PMOP)肾阴虚证的关联性。方法:随机选取PMOP肾阴虚证患者25例作为PMOP肾阴虚证组,选取36名健康绝经后妇女为健康对照组,运用RT-PCR法检测外周血LRG1、SRC mRNA的表达。结果:PMOP肾阴虚证组LRG1 mRNA表达水平(1.5442±0.8439)高于健康对照组(1.1271±0.6055),差异有统计学意义(Z=-2.156,P=0.031),PMOP肾阴虚证组SRC mRNA表达水平(1.4484±1.0517)与健康对照组(1.2931±0.8895)比较,有升高趋势,但差异无统计学意义。结论:LRG1 mRNA表达水平升高与PMOP肾阴虚证具有关联性。

hsa-miR-655靶向CLCF1基因对人成骨肉瘤MG63细胞OPG/RANKL系统表达的影响

目的探讨hsa-miR-655通过靶向调控心肌营养素样细胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1,CLCF1)基因表达,对人成骨肉MG63细胞系增殖、护骨素(osteoprotegerin,OPG)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)表达的影响。方法通过hsa-miR-655慢病毒转染MG63细胞进行功能获得实验。实验分阴性对照组(NC组)和hsa-miR-655过表达组(OE组),荧光显微镜和流式细胞术(flow cytometry analysis,FCM)评估转染效率,Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖能力,FCM检测细胞周期分布,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测hsa-miR-655、CLCF1、OPG和RANKL mRNA的水平,蛋白质印迹法(Western blot)检测CLCF1、OPG及RANKL蛋白的变化。结果荧光显微镜和FCM显示对照组和miR-655过表达组感染效率为80%以上;qRT-PCR结果显示,相对于对照组,过表达组MG63细胞hsa-miR-655表达上调,差异有统计学意义(P=0.0004);CLCF1 mRNA水平未见明显变化(P=0.0986);过表达组OPG(P=0.0384)、RANKL(P=0.0007)mRNA均有所上调,差异具有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示,过表达组CLCF1蛋白水平表达下调(P=0.0053);与对照组比较,过表达组OPG(P=0.0021)、RANKL(P=0.0002)蛋白均上调,而OPG/RANKL比值却降低(P=0.0078),差异具有统计学意义(P<0.05);CCK-8细胞增殖实验结果显示,miR-655过表达后抑制MG63细胞增殖;FCM检测细胞周期结果显示,miR-655过表达后MG63细胞G0/G1期细胞比例增加,S期减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论hsa-miR-655通过负调控CLCF1基因的表达,抑制MG63细胞的增殖,下调OPG/RANKL的比值。

JAK/STAT通路介导的六味地黄丸对绝经后骨质疏松症肾阴虚证的免疫调节作用

目的:探讨六味地黄丸对绝经后骨质疏松症(POP)肾阴虚证的免疫调节作用及其与JAK/STAT信号通路的关系。方法:随机选择POP肾阴虚证受试者25例,予以六味地黄丸治疗3个月,实时荧光定量PCR(q RTPCR)检测外周血白细胞JAK/STAT通路相关基因OSM、PRLR、IFNG、IRF1和YY1的表达;ELISA法检测血清中免疫因子白细胞介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。结果:六味地黄丸治疗POP肾阴虚证组3个月后,IRFI基因表达上调,治疗前后比较有显著性差异(P<0.01);OSM基因表达虽有上调趋势,PRLR、IFNG和YY1基因表达水平下降,但差异均无统计学意义;血清IL-6、IL-8含量明显降低,治疗前后比较有显著性差异(P<0.05,P<0.01);TNF-α水平在治疗后表达下调,但差异无统计学意义。结论:六味地黄丸可能通过上调JAK/STAT通路中IRF1基因的表达,调控POP肾阴虚证免疫功能。

续苓健骨方对骨质疏松模型大鼠骨密度及骨生物力学的影响

目的：研究续苓健骨方对骨质疏松模型大鼠骨密度、骨生物力学指标的影响。方法将40只SD雌性大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、钙尔奇D组和续苓健骨方组各10只。除假手术组外，其余各组制备骨质疏松模型。造模后30 d开始灌胃给药，钙尔奇D组大鼠灌胃钙尔奇D混悬液0.126 g/kg；续苓健骨方组灌胃续苓健骨方药液15 g/kg；假手术组和模型组灌胃等体积生理盐水，1次/d。给药12周后取材。采用双能X射线检测左胫骨骨密度，三点弯曲法行骨生物力学检测。结果续苓健骨方组骨密度[（0.244±0.022）g/cm2比（0.195±0.017）g/cm2]较模型组增高（P＜0.01），且明显高于钙尔奇 D组[（0.244±0.022）g/cm2比（0.223±0.013）g/cm2]；续苓健骨方组断裂点荷载[（0.072±0.036）kN 比（0.041±0.015）kN]、应力[（843.754±428.722）N/mm2比（482.084±176.646）N/mm2]较模型组增高（P＜0.05）。结论续苓健骨方可提高骨质疏松模型大鼠的骨密度，改善骨生物力学性能。

续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1细胞分化及增殖的影响

目的 探讨续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1成骨细胞分化及增殖的影响。 方法 制备续苓健骨汤含药血清,实验分为空白对照组、含药血清低剂量组、中剂量组和高剂量组。采用CCK-8法和流式细胞术检测续苓健骨汤含药血清对MC3T3-E1细胞增殖和细胞周期的影响;碱性磷酸酶(ALP)活性测定MC3T3-E1细胞的成骨分化能力;茜素红染色检测MC3T3-E1细胞的矿化能力;实时荧光定量PCR检测成骨分化基因Runx2、OC、Bmp2、Col1a1mRNA水平。 结果 与空白对照组比较,中、高剂量续苓健骨汤含药血清能促进 MC3T3-E1 细胞增殖、S期细胞比率和细胞增殖指数,并且呈现一定的剂量依赖性;同时中高剂量续苓健骨汤含药血清组能明显提高 MC3T3-E1 细胞ALP活性( P <0.01)和钙化能力( P <0.01),促进 Runx2、OC、Bmp2、Col1a1 mRNA的表达( P <0.05)。 结论 续苓健骨汤含药血清能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖,并通过上调骨形成相关基因Runx2、OC、BMP2、Col1a1的表达水平,提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。