《中兽医学》实验课程教学改革探讨与实践

《中兽医学》实验是动物医学专业的一门重要专业课。为了提高《中兽医学》实验课教学效果,针对传统实验教学过程存在的诸多不足,从教学内容、教学手段、方法和考核方式上进行课程教学改革。通过精心设计实验、丰富教学手段和改进教学方法,优化考核方式,充分发挥学生的积极性和主动性,增强学生分析问题和解决问题的能力,提高教学质量。

猪源葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析

为明确从福建某规模猪场分离到的病原菌及其生物学特性、致病性与耐药等特征,为疫病的防治提供参考依据。对分离菌进行纯化,采用革兰氏染色、PCR鉴定、药敏试验、消毒剂消杀试验、耐药基因检测及动物攻毒试验等,对分离菌进行生物学特性、耐药等相关检测。结果显示,分离菌为猪源葡萄球菌。该菌对30种常用抗菌药物中的苯唑西林、诺氟沙星、头孢类等14种药物高度敏感,对阿米卡星、庆大霉素、四环素、万古霉素、氟苯尼考5种药物中度敏感,对氨苄西林、哌拉西林、卡那霉素等11种药物不敏感,检测cfr、tetM、floR、mcr-1、bla NDM-1、optrA 6种耐药基因均为阴性;该菌对26种中药中的单宁酸高度敏感,对五味子、五信子多酚中度敏感,对叶下珠、厚朴、虎杖低度敏感,对半边莲、铁苋菜、艾叶、重楼等20种中药不敏感;在8种消毒剂中,84消毒液对该分离菌的消杀效果差,新洁尔灭、月苄三甲氯铵、复合酚3种消毒剂对该分离菌消杀效果好;动物攻毒试验表明,该菌对25日龄健康断奶仔猪具有强致病性,能导致猪出现典型的葡萄球菌病临床症状和病理特征,攻菌猪组织病理可见脾脏红髓淤血、肺泡腔内见红细胞渗出及少量粉染的渗出物。研究结果可为在养殖饲料端禁止添加抗生素的背景下,为猪葡萄球菌病的防治提供理论参考和技术支撑。

牛至香酚对LPS免疫应激小鼠血清细胞因子含量和肠道细胞因子、紧密连接蛋白表达水平的影响

【目的】旨在探究牛至香酚是否能有效改善脂多糖(LPS)免疫应激小鼠免疫功能的损伤。【方法】将80只小鼠随机分成空白对照组、模型组和牛至香酚低、中、高剂量组。牛至香酚低、中、高剂量组分别按25、50、100 mg·kg^(-1)的剂量灌胃牛至香酚,空白对照组和模型组按10 mL·kg^(-1)的剂量灌胃橄榄油,每日1次,连续14 d。第15天时,牛至香酚组和模型组小鼠腹腔注射8 mg·kg^(-1)LPS,空白对照组注射等量生理盐水,6 h后采集血液和肠道组织,检测小鼠血清细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10)含量和肠道细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10)、紧密连接蛋白(ZO-1、Occludin、Claudin-1)mRNA的表达水平。【结果】(1)与空白对照组相比,模型组小鼠血清TNF-α、IL-10、IL-1β含量上升(P>0.05),IL-6含量极显著上升(P<0.01);模型组回肠和结肠组织TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达水平极显著上调(P<0.01),回肠和结肠组织ZO-1 mRNA表达水平下调(P>0.05),结肠组织Occludin、Claudin-1 mRNA表达水平极显著下调(P<0.01)。(2)与模型组相比,牛至香酚试验组小鼠血清IL-6含量极显著下降(P<0.01),IL-1β含量显著下降(P<0.05);牛至香酚高剂量组血清TNF-α含量极显著下降(P<0.01);牛至香酚中、高剂量组血清IL-10含量显著上升(P<0.05)。(3)同模型组相比,牛至香酚中、低剂量组回肠组织IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平极显著下调(P<0.01);牛至香酚中、高剂量组回肠组织ZO-1、Occludin mRNA表达水平极显著上调(P<0.01);牛至香酚高剂量组结肠组织IL-10 mRNA表达水平极显著上调(P<0.01),TNF-αmRNA表达水平极显著下调(P<0.01),Occludin、Claudin-1 mRNA表达水平极显著上调(P<0.01)。【结论】牛至香酚通过改变小鼠血清细胞因子含量和肠道细胞因子、紧密连接蛋白mRNA的表达水平,调节LPS免疫应激小鼠的免疫功能。

饲粮添加姜黄粉对黄羽肉鸡生产性能和免疫性能的影响

本试验旨在研究饲粮添加姜黄粉对黄羽肉鸡生产性能和免疫性能的影响。试验选用320羽1日龄黄羽肉鸡,随机分成4组,每组8个重复,每个重复10羽。对照组饲喂基础饲粮,试验组分别在基础饲粮中添加150 mg/kg姜黄素(姜黄素组)、5 g/kg姜黄粉(0.5%姜黄粉组)和10 g/kg姜黄粉(1.0%姜黄粉组),其中姜黄粉组饲粮用姜黄粉替代等量的谷壳糠。试验期70 d。结果表明:1)与对照组相比,姜黄粉组肉鸡29~70日龄料重比显著降低(P<0.05),1.0%姜黄粉组1~70日龄料重比显著降低(P<0.05),且饲粮添加姜黄粉对屠宰性能、肌肉剪切力和肉色无显著影响(P>0.05)。2)与对照组相比,0.5%姜黄粉组肉鸡肌肉必需氨基酸、总氨基酸和总脂肪酸含量显著提高(P<0.05)。3)与对照组相比,饲粮添加姜黄粉可显著提高肉鸡胸腺指数、血清禽流感抗体含量以及血清免疫球蛋白、补体、白细胞介素、干扰素-γ和溶菌酶含量(P<0.05)。4)与对照组相比,饲粮添加姜黄粉可显著下调肉鸡免疫器官核因子-κB(NF-κB)、转化生长因子β活化激酶1(TAK1)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA相对表达量(P<0.05)。综上所述,饲粮添加姜黄粉能降低黄羽肉鸡料重比,促进其生长;提高肉品质,提升其营养价值;调节NF-κB信号通路相关基因的表达,减轻炎症,调节黄羽肉鸡免疫性能,提高其生产性能。

太子参多糖对卵清白蛋白诱导免疫抑制小鼠肠道免疫应答影响的研究

为研究太子参多糖(PHPS)对模式抗原卵清白蛋白(OVA)引起免疫抑制小鼠肠道免疫应答能力的影响,本研究将84只雄性ICR小鼠随机均分为7组,即PBS对照组(PBS组)、环磷酰胺对照组(CY组)、OVA单独免疫组(OVA-CY组)、铝佐剂对照组(OVA-CY-AL组)、OVA-CY-PHPS低、中、高剂量组(OVA-CY-PHPS-L组、OVACY-PHPS-M组、OVA-CY-PHPS-H组)。除PBS组以外,各组小鼠均于实验开始后1 d~3 d和18 d分别经腹腔注射环磷酰胺(CY,50 mg/kg),建立免疫抑制小鼠模型。于实验开始后4 d~8 d和19 d~23 d,OVA-CY-PHPS-L组、OVA-CY-PHPS-M组、OVA-CY-PHPS-H组小鼠分别灌胃对应剂量PHPS (50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg),PBS组、CY组、OVA-CY组和OVA-CY-AL组小鼠灌胃等体积双蒸水;第9 d和24 d,OVA-CY-PHPS-L组、OVA-CY-PHPS-M组、OVA-CY-PHPS-H组、OVA-CY组小鼠均经腹股沟皮下注射100μg OVA (0.2 m L/只)进行一免和二免。PBS组与CY组小鼠经相同方式注射等体积无菌PBS,OVA-AL组小鼠经相同方式注射OVA/铝佐剂混合液(OVA 100μg+Alum 200μg) 0.2 m L/只。第38 d剖杀各组小鼠,制作十二指肠、空肠、回肠病理切片观察小鼠肠道病变,采用Image-Pro Plus 6.0软件计算各肠段绒毛高度、隐窝深度、肠道上皮中的淋巴细胞数量;采用ELISA法检测各组小鼠各肠段IL-6、TNF-α含量、分泌型免疫球蛋白A (SIgA)抗体水平;采用荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)法检测各组小鼠各肠段细胞因子m RNA的相对转录水平。结果显示,与OVA-CY组相比,各剂量PHPS均能改善免疫抑制小鼠肠道绒毛稀疏、肿胀、破裂的情况,低剂量的PHPS能够显著提高免疫抑制小鼠十二指肠、空肠绒毛高度与隐绒比(V/C)值(P<0.05),低、高剂量的PHPS均能够显著提高免疫抑制小鼠回肠的肠绒毛高度与V/C值(P<0.05);较OVA-CY组,高剂量PHPS能够显著提高免疫抑制小鼠空肠上皮内淋巴细胞的数量(P<0.05),低、高剂量PHPS能够显著提高免疫抑制小鼠回肠上皮内淋巴细胞的数量(P<0.05);与OVA-CY组相比,各剂量PHPS均能够显著提高免疫抑制小鼠十二指肠中IL-6含量及各肠段中TNF-α含量和SIg A抗体水平(P<0.05);与OVA-CY组相比,各剂量PHPS均能够显著上调免疫抑制小鼠各肠段IL-6和TNF-α m RNA的相对转录水平(P<0.05)。上述结果表明,PHPS能在一定程度上修复免疫抑制小鼠肠道黏膜结构的损伤,调节其细胞因子的分泌及其基因的转录水平,增强肠道黏膜免疫功能,从而提高免疫抑制小鼠对OVA的免疫应答能力。本研究为PHPS对动物肠道免疫调节作用的研究提供参考,为进一步开发PHPS提供借鉴。

芪蓝复方对妊娠母猪免疫增强作用研究

【目的】揭示芪蓝复方对妊娠母猪免疫功能的增强作用,为缓解妊娠母猪免疫抑制提供参考,为芪蓝复方的临床应用提供数据支撑。【方法】采用加热回流、浓缩冻干工艺制备芪蓝复方提取物,利用硫酸-苯酚法、高效液相色谱法和紫外分光光度法检测芪蓝复方的主要有效成分含量。选取25头长白二元母猪(30~40胎龄),分为空白组(N),0.1%(L)、0.2%(M)和0.4%(H)芪蓝复方组以及阳性对照组(A),5头/组,试验期30 d,分别于试验开始后1、15和29 d采集血液,检测血清生化指标(总蛋白、白蛋白、尿素氮、葡萄糖、血钙、血磷和甘油三酯)、血清抗氧化指标(总抗氧化能力、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和丙二醛)、免疫球蛋白(IgG、IgM和IgA)、炎症因子(白细胞介素-6(IL-6)和IL-1β)以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体水平。【结果】芪蓝复方中多糖、(R,S)-告依春以及淫羊藿苷含量分别为56.0%、0.035%和0.39%。妊娠15、29 d,与N组相比,A组猪血清白蛋白、IgM、IgA含量及总抗氧化能力、谷胱甘肽过氧化物酶活性均显著升高(P<0.05);L、H组谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性均显著升高(P<0.05);各组丙二醛、IL-1β含量均显著降低(P<0.05);M、H组S/P值均显著降低(P<0.05)。与A组相比,妊娠15 d, L组血清总蛋白、血钙水平、总抗氧化能力及IgM、IgA含量均显著降低(P<0.05);H组超氧化物歧化酶活性显著升高,血清总蛋白、血钙、甘油三酯水平及IgM、IL-6含量、S/P值均显著降低(P<0.05)。妊娠29 d, L组血清总抗氧化能力、血钙水平、IgG、IgA含量均显著降低(P<0.05);M组血钙水平、超氧化物歧化酶活性、IL-1β含量均显著降低(P<0.05)。【结论】芪蓝复方对妊娠母猪免疫功能具有显著增强作用,可用于妊娠母猪免疫抑制疾病防控。

一株血清8a型禽腺病毒的分离鉴定及致病性分析

【目的】研究福建南平地区禽腺病毒(FAdV)血清8a型分离株的遗传演化情况及致病性,旨在为防控血清8a型FAdV感染提供参考。【方法】2022年8月,采集福建南平地区部分肉鸡养殖场出现的以包涵体肝炎为特征的肝脏病料,采用PCR技术检测FAdV核酸,将获得的阳性样品接种在无特定病原体(SPF)鸡胚上进行病原的分离纯化,利用hexon基因测序及序列分析等方法进行病毒鉴定,并在测定分离株毒力的基础上进行动物致病性试验。【结果】接种10 d后,鸡胚死亡,肝脏肿大、出血、坏死、呈土黄色;PCR鉴定和hexon基因序列分析表明,分离株与GenBank上的FAdV E型8a血清型澳大利亚TR59毒株的序列同源性高达99.5%,将该分离株命名为FJNP。FJNP株对1日龄SPF鸡的致死率为44%(11/25);剖检显示,感染鸡肝脏肿大、出血、边缘钝圆、呈土黄色、出现白色坏死点,脾脏和肾脏也出现肿大、出血等症状;肝脏组织病理学检查结果显示,感染鸡肝细胞大量变性坏死,肝细胞核可见嗜碱性包涵体及大量淋巴细胞浸润。实时荧光定量PCR检测显示,感染鸡体内多个组织器官均检测到病毒,且主要分布在肝脏,攻毒3、5、7、14、21 d在泄殖腔中均能检测到病毒。【结论】本研究从临床表现为包涵体肝炎的病鸡肝脏病料中分离到一株具有较强致病性的血清8a型FAdV。

福建白羽肉鸡鸡毒支原体的分离鉴定及最小抑菌浓度测定

为了解福建白羽肉鸡中鸡毒支原体(MG)对临床常用药物的敏感性,本研究从2个商品代白羽肉鸡养殖场采集了疑似患慢性呼吸道病(CRD)的鸡喉拭子40份,接种于适宜的支原体培养基上进行纯化。通过对菌株生物学特性分析、细菌形态学观察、PCR测序及动物回归试验进行鉴定,并利用最低抑菌浓度(MIC)测定了分离株对临床常用抗菌药的敏感性。结果显示,本试验成功获得2株MG,命名为MX和HY。将分离株接种于含有酚红的支原体液体培养基中能分解葡萄糖产酸使培养基颜色由红变黄;固体培养基于低倍镜下观察到典型的“荷包蛋”状菌落;分离株经过Dienes染色后的菌落中心呈致密深蓝色,边缘淡蓝,且30 min后不褪色,并具有较强吸附红细胞的能力,呈现典型MG培养特征;动物回归试验和分离株pvpA基因测序结果显示,2株MG分离株均具有较强致病性,证实其与R株的亲缘关系最近;药敏试验结果显示,MX和HY对泰妙菌素、氟苯尼考和泰乐霉素表现出了高度敏感性,其次是盐酸恩诺沙星、盐酸大观霉素,而对具有与泰乐霉素类似分子结构和抗菌谱的畜禽专用抗生素替米考星敏感性较差,此差异可能与临床上长期应用该药有关。研究结果表明,福建地区商品代白羽肉鸡中存在致病性MG流行,泰妙菌素可以作为临床防治MG的首选药物。

蛋鸡的产业发展现状及中药在蛋鸡非传染性疾病防治中的作用

中药具有增强蛋鸡免疫、提高产蛋率、改善蛋品质的作用。概述国内外蛋鸡产业的发展现状,总结影响蛋鸡生产的非传染性因素及其机制,对中药调节营养吸收和缓解应激的进行分析,为阐明中药在治疗蛋鸡非传染性疾病的作用提供参考。

姜黄素通过SIRT1/FOXO1通路缓解玉米赤霉烯酮诱导的猪肾上皮细胞氧化损伤

【目的】探究姜黄素(Cur)对玉米赤霉烯酮(ZEA)诱导猪肾上皮细胞(PK-15)氧化损伤的保护作用,并基于SIRT1/FOXO1信号通路阐明其作用机制,为姜黄素的兽医临床应用提供依据。【方法】试验分为5组:对照组、ZEA组(36.55μg·mL^(-1)ZEA)、Cur 6.25组(36.55μg·mL^(-1)ZEA+6.25μmol·L^(-1)Cur)、Cur 12.5组(36.55μg·mL^(-1)ZEA+12.5μmol·L^(-1)Cur)、Cur 25组(36.55μg·mL^(-1)ZEA+25μmol·L^(-1)Cur);通过MTT法测定ZEA的半数抑制浓度和Cur对PK-15细胞的最大安全浓度;使用倒置显微镜观察PK-15细胞的形态变化;采用试剂盒检测细胞内活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及丙二醛(MDA)的水平;qRT-PCR检测细胞SIRT1、FOXO1、CAT、Mn-SOD的mRNA水平;Western Blot检测SIRT1、FOXO1和Acetyl-FOXO1蛋白的表达量。【结果】ZEA的IC50为36.55μg·mL^(-1),Cur的最大安全浓度为25μmol·L^(-1);与对照组相比,ZEA极显著降低PK-15细胞活力(P<0.01),极显著提高ROS和MDA水平(P<0.01),极显著降低SOD、CAT活性(P<0.01);与ZEA组对比,不同浓度的Cur(6.25、12.5、25μmol·L^(-1))显著提高PK-15细胞的存活率(P<0.05),改善细胞形态;极显著(P<0.01)降低ZEA诱导的ROS和MDA水平;极显著升高细胞内SOD和CAT活性(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,ZEA降低SIRT1 mRNA表达量,极显著升高FOXO1 mRNA表达量(P<0.01),升高Mn-SOD mRNA表达量,极显著降低CAT mRNA表达量(P<0.01)。与ZEA组对比,各Cur组不同程度的升高SIRT1和CAT的mRNA表达量,极显著的降低FOXO1的mRNA表达量(P<0.01);极显著升高Mn-SOD的mRNA表达量(P<0.01)。Western Blot结果表明,与对照组对比,ZEA显著降低SIRT1蛋白表达(P<0.05),极显著升高Acetyl-FOXO1蛋白表达(P<0.01);与ZEA组对比,各Cur组均极显著升高SIRT1蛋白表达(P<0.01),极显著降低Acetyl-FOXO1蛋白表达(P<0.01)。【结论】Cur可以上调SIRT1的表达,降低FOXO1的乙酰化水平,诱导抗氧化酶Mn-SOD和CAT的表达,从而清除ROS,降低MDA水平,减轻ZEA对PK-15细胞的氧化损伤作用。

姜黄素对过氧化氢诱导的罗非鱼肝细胞热休克蛋白基因表达的影响

【目的】探究热休克蛋白基因在氧化应激和姜黄素作用下的表达差异,了解姜黄素药效的发挥与热休克蛋白基因表达变化的关系,进一步探讨热休克蛋白对氧化应激条件下鱼类肝细胞中的功能,为鱼类氧化应激的毒理学机制及姜黄素的药理学机制提供理论资料。【方法】对24 h姜黄素预处理(保护组)与无姜黄素预处理(对照组)的罗非鱼肝细胞分别进行0、1、2.5 h的H_(2)O_(2)应激,并对肝细胞5种高分子热休克蛋白基因(HSP70、HSP90α、HSP90β、HSP60、HSP75)和5种小分子热休克蛋白基因(HSP30、HSPB1、HSPB7、HSPB8、HSPB11)的表达水平进行qPCR检测。【结果】与不经H_(2)O_(2)处理(0 h)相比,H_(2)O_(2)作用1 h能显著提升HSPB1表达量,降低HSP30表达量;H_(2)O_(2)作用2.5 h能显著提升HSP90a、HSPB1的表达量。姜黄素预处理24 h能显著提升HSP70、HSP90α、HSP30、HSPB1的表达量;姜黄素预处理24 h后再进行H_(2)O_(2)应激1 h时,HSP70、HSP90α、HSP30的表达量显著高于H_(2)O_(2)单独应激(对照组);姜黄素预处理24 h后再进行H_(2)O_(2)应激2.5 h时,HSP90α、HSP30、HSPB1的表达量显著高于H_(2)O_(2)单独应激。其余热休克蛋白在试验过程中无显著差异。【结论】H_(2)O_(2)单独应激可引起罗非鱼肝细胞HSP90a、HSP30、HSPB1基因的表达量变化,而姜黄素预处理能提高多种热休克蛋白基因的表达,提高了罗非鱼肝细胞的抗氧化能力,最终抵御H_(2)O_(2)引起的氧化应激并维持细胞活力。

乳酸菌素PlnJ第5位氨基酸(赖氨酸)定点突变对其热稳定性的影响

利用生物信息学软件I-Mutant2.0分析植物乳酸菌素PlnJ的氨基酸序列,筛选出最不稳定的氨基酸位点,进行定点突变,构建点突变重组表达质粒。对点突变重组表达质粒进行原核表达,并筛选表达最适条件;采用镍亲和层析法纯化重组蛋白。以大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌作为指示菌,探究100℃水浴加热0、5、15、30 min对重组PlnJ抑菌功能的影响。结果表明,PlnJ第3位氨基酸——赖氨酸(AAG)对其稳定性具有重大影响。以人工合成第5位氨基酸,即赖氨酸(AAG)突变为缬氨酸(GTG)的PlnJ核苷酸序列作为模板,成功构建重组表达质粒,PCR和酶切鉴定结果显示目的条带184 bp,测序后证明突变成功。重组蛋白诱导表达条件的优化结果表明:在37℃、12 h、0.8 mmol·L^(-1)IPTG的最优诱导条件下,特异目的蛋白表达显著(27.5 ku);咪唑洗脱液浓度280 mmol·L^(-1)是最优洗脱条件,可获得较为单一的目的蛋白。采用牛津杯抑菌试验法及麦氏比浊法比较突变前后的PlnJ蛋白的抑菌效果,结果表明,突变后的蛋白[PlnJ(G5)]与突变前的蛋白(PlnJ)100℃加热0、5、15、30 min,对大肠杆菌的抑菌效果均差异显著(P<0.05),而对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果均差异极显著(P<0.01)。并且,无论是否经过30 min加热,PlnJ(G5)的抑菌效果差异均不显著(P>0.05)。综上,第5位氨基酸,即赖氨酸(AAG)突变为缬氨酸(GTG)后,PlnJ(G5)的热稳定性得到了提高,且不改变其抑菌效果。

太子参参须多糖对RAW264.7细胞免疫调节作用的研究

为研究太子参参须多糖(RPFRP)对小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞)的免疫调节作用及作用机制,本研究利用MTT法检测不同浓度RPFRP作用下的RAW264.7细胞的增殖情况,筛选出RPFRP的适宜浓度为25μg/mL~400μg/mL。将25μg/mL~400μg/mL RPFRP作用于RAW264.7细胞并于不同时间后收获细胞培养物或上清液进行后续试验。采用中性红法检测不同浓度RPFRP作用下的RAW264.7细胞的吞噬活性,结果显示:RPFRP可极显著提高RAW264.7细胞吞噬活性(P<0.01),且该吞噬活性在PRFRP浓度为25μg/mL~200μg/mL时呈剂量依赖式升高;Griess法检测RAW264.7细胞的NO产生量,结果显示:RAW264.7细胞上清液中NO含量显著升高(P<0.05),且呈RPFRP剂量依赖式升高;ELISA法检测RAW264.7细胞的白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,结果显示:与空白对照组相比,RPFRP处理的RAW264.7细胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10的含量极显著或显著上升(P<0.01、P<0.05),且在RPFRP浓度为25μg/mL~200μg/mL时呈剂量依赖式升高;qRT-PCR检测RAW264.7细胞的诱导型-氧化氮合酶(iNOS)、细胞因子、核转录因子-κB(NF-κB)、髓样分化因子88(MyD88)和Toll样受体4(TLR4)mRNA转录水平,结果显示:RPFRP处理的RAW264.7细胞中iNOS、IL-6、IL-10、TNF-α的mRNA转录水平均呈剂量依赖式增加(P<0.01),IL-1β、MyD88和NF-κB的mRNA转录水平在RPFRP浓度为25μg/mL~200μg/mL时呈剂量依赖式升高(P<0.01),仅在RPFRP浓度为400μg/mL时有所降低,而TLR4 mRNA的转录水平则呈剂量依赖式降低(P<0.01);western blot检测RAW264.7细胞中TLR2、TLR4、β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)、MyD88、NF-κB抑制蛋白α(IκB-α)、NF-κB蛋白中表达水平,结果显示:RPFRP处理的RAW264.7细胞中TLR2、MyD88、TRIF与胞核NF-κB蛋白的表达水平提高且在RPFRP浓度为50μg/mL~200μg/mL时呈剂量依赖式升高,而该细胞中TLR4、IκB-α和胞浆NF-κB蛋白的表达水平则在RPFRP浓度为50μg/mL~200μg/mL时呈剂量依赖式下降。综上可知,RPFRP可通过提高RAW264.7细胞的增殖能力、吞噬活性、分泌NO和细胞因子的能力等增强RAW264.7细胞的免疫功能,且RPFRP对RAW264.7细胞的免疫调控机制可能是通过TLR2/4-MyD88/TRIF-NF-κB信号通路活化RAW264.7细胞来完成。

一株鸡传染性法氏囊病毒变异株的鉴定与致病性

近日,在福建省南平市某鸡场发现一株新的鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)流行株,并将其命名为IBDV-FJ02.为了明晰IBDV-FJ02株遗传变异情况和临床致病特征,进行了A节段基因组序列和特征性氨基酸位点的分析、基于A节段和B节段的新型基因型分类以及对无特定病原体(SPF)鸡致病性的研究,旨在为鸡传染性法氏囊病的防治提供依据.结果显示:IBDV-FJ02株A节段核苷酸序列与早期变异株E的同源性最高,达95.6%,与中国变异株SHG558在同一分支上;IBDV-FJ02株VP2-4-3蛋白氨基酸序列第222位氨基酸为T,第249位为K,第318位为D,参考变异株中仅GLS、E与其一致,位点N^(213)、T^(222)、K^(249)、 D^(318)、E^(323)均符合变异株的特征.根据新型基因型分类方案,显示IBDV-FJ02株属于A2dB1基因型,即IBDV新型变异株类群.致病性测定结果显示:IBDV-FJ02株感染3周龄SPF鸡并不会导致感染鸡只死亡,在感染后21 d内,主要引起鸡只法氏囊的严重萎缩和脾脏的轻微肿大.上述结果表明,IBDV-FJ02株是一种IBDV新型变异株,具有明显的IBDV变异株致病特点.

基于鸡毒支原体黏附素蛋白的表位疫苗制备及免疫效果评价

旨在使用鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)的黏附蛋白设计一种更安全、有效的多表位候选疫苗。本研究运用生物信息学方法对鸡毒支原体的多个黏附素蛋白(CrmA、GapA、Mgc2、PvpA)的B、T细胞表位进行预测。将筛选的抗原表位合成新的表位基因肽段(命名为mEA)。通过生物学在线软件分析了mEA的二级结构、亲水性、抗原性、三级结构。构建重组质粒pET32a-MG-mEA,经限制性内切酶(BamHⅠ和HindⅢ)酶切鉴定及DNA测序鉴定后导入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达和纯化。Western blot验证重组蛋白与鸡MG阴性/阳性血清的反应性。纯化的MG-mEA重组蛋白与佐剂1∶1混匀,制备为多表位疫苗,通过SPF鸡免疫试验分析融合蛋白免疫原性。结果显示,mEA序列二级结构较稳定,抗原性良好。重组质粒经PCR扩增获得1680 bp大小的目的条带,与预计相符。SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约48 ku,主要以可溶性形式存在。Western blot试验证明该蛋白反应原性良好。多表位疫苗免疫SPF鸡,经ELISA检测显示:二免后10 d各免疫组抗体水平达到最高,3个重组蛋白免疫组与PBS组相比差异均具有显著统计学意义(P<0.05)。攻菌结果表明,MG感染明显损伤了气管黏膜结构,而重组蛋白+佐剂制备的疫苗能够有效保护MG的损伤。综上,本研究结果为研制安全有效的候选MG疫苗提供了新的途径。

太子参参须提取物对免疫抑制小鼠的免疫调节作用

本试验旨在探讨太子参参须提取物(RPFRE)对环磷酰胺(CTX)所致免疫抑制小鼠的免疫调节作用。腹腔注射CTX建立免疫抑制模型小鼠,以黄芪多糖(APS)为阳性对照,用不同剂量的RPFRE灌胃免疫抑制小鼠2周,检测免疫器官指数、巨噬细胞吞噬功能、脾淋巴细胞增殖、细胞因子含量等免疫学指标。结果显示,给予高剂量RPFRE[400 mg/(kg·bw)]的免疫抑制小鼠脾脏指数极显著降低(P<0.01),肝脏指数极显著升高(P<0.01),胸腺指数有所升高,但差异不显著(P>0.05);碳粒廓清指数K、吞噬指数α、脾T、B淋巴细胞刺激指数(SI)、血清细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6含量均显著升高(P<0.05或P<0.01),效果与APS相当;给予低[100 mg/(kg·bw)]、中[200 mg/(kg·bw)]剂量RPFRE的免疫抑制小鼠上述指标变化趋势与高剂量组相同。结果表明,RPFRE能增强免疫抑制小鼠的免疫功能。

猴头菇多糖对氧化应激状态下仔猪回肠形态结构及通透性的影响

本试验旨在探究氧化应激状态下猴头菇多糖(HEP)对断奶仔猪回肠形态结构及通透性的影响。将45头健康的(28±3)d断奶仔猪按体重相近原则分为5组,空白组和模型组饲喂基础日粮,试验组在基础日粮中分别添加0.2%、0.4%、0.6%的HEP。于试验第21天,对模型组和HEP组按体重注射100μg·kg-1脂多糖(LPS),空白组注射等剂量灭菌生理盐水;前腔静脉采血15mL,分离血清,用于检测抗氧化指标和肠黏膜完整性指标;宰杀试验猪,分离回肠,HE染色观察其形态变化;qPCR和Western blot法检测回肠紧密连接蛋白的表达情况。结果显示,同模型组比较,HEP能显著改善LPS应激造成的血清抗氧化指标下降(P<0.05);显著提高仔猪血清中谷氨酰胺(GLN)含量(P<0.05),降低二胺氧化酶(DAO)活性(P<0.05),缓解LPS导致的仔猪回肠黏膜损伤;使得LPS应激诱导的回肠上皮细胞紧密连接蛋白表达下降显著回升(P<0.05)。饲料中添加HEP能够有效改善氧化应激状态下仔猪的回肠形态结构及通透性。

番鸭呼肠孤病毒感染对雏番鸭肠黏膜组织结构及肠道免疫细胞的影响

为探究番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染对雏番鸭肠黏膜免疫的影响,本研究将100只1日龄MDRV抗原抗体阴性雏番鸭随机分为二组:空白对照组(NCG)和MDRV同居感染组(CIG),利用人工感染发病的20只番鸭对GIC组番鸭进行同居感染。NCG和CIG组番鸭分别于后者同居感染1 d、3 d、6 d、10 d、15 d、21 d后采集其十二指肠、空肠、回肠样品进行肠道形态结构(绒毛高度、宽度、V/C值、肠壁厚度、绒毛表面积)的观察及免疫相关细胞(上皮内淋巴细胞、杯状细胞、肥大细胞)的检测。结果显示:与NCG相比,CIG番鸭肠道绒毛高度下降、宽度变窄,排列稀疏,V/C值降低,绒毛表面积下降,肠壁厚度变薄,上皮内淋巴细胞、杯状细胞、肥大细胞数量下降,尤其是同居感染6 d以后其各项检查指标均与NCG差异极显著(p<0.01)。表明MDRV可导致肠道消化吸收功能障碍和黏膜免疫抑制。该研究结果进一步充实MDRV感染的致病机制。

“芪苓散”超微粉对河田鸡血清抗氧化性能及免疫生化指标的影响

为探讨"芪苓散"超微粉对河田鸡血清抗氧化性能及免疫生化指标的影响,试验选取630只1日龄河田鸡公雏随机分成3组(空白对照组、抗生素组、中药组)进行研究。试验期105 d。每组分别于28、56、105日龄采血分离血清,测定血清抗氧化、免疫和生化指标。结果显示:与对照组相比,复方中药超微粉显著提高28日龄河田鸡血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性及溶菌酶、补体C4和免疫球蛋白M(IgM)含量,显著提高56日龄免疫球蛋白G(IgG)含量,显著提高105日龄T-SOD活性及IgG、总蛋白和球蛋白含量,显著降低105日龄河田鸡血清中总胆固醇含量(P<0.05)。试验表明"芪苓散"超微粉可以提高河田鸡抗氧化能力和免疫能力,具有一定降低河田鸡血脂的保健作用。

猴头菇多糖对氧化应激的IPEC-J2细胞抗氧化能力及紧密连接蛋白ZO-1的影响

旨在探究在H_2O_2诱导的氧化应激损伤状态下,猴头菇多糖(HEPs)对IPEC-J2细胞的保护作用。将IPEC-J2细胞分为5组:空白组、模型组、HEPs低剂量组、HEPs中剂量组、HEPs高剂量组。采用MTT法分别选取试验用的H_2O_2和HEPs的最佳剂量;利用DCFH-DA染色观察并测定细胞内活性氧簇(ROS)的含量;通过比色法检测培养细胞上清液中丙二醛(MDA)的含量,细胞中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活力以及乳酸脱氢酶(LDH)的释放率;应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测紧密连接蛋白ZO-1基因的转录水平。结果显示,(1)构建IPEC-J2细胞氧化应激模型的H_2O_2浓度为0.4mmol·L-1。(2)H_2O_2能够极显著地增加细胞内的ROS含量,诱导细胞凋亡,同时极显著地降低了SOD和CAT的活力,极显著地升高MDA含量与LDH释放率。但是,与模型组相比,经过HEPs预处理后,细胞内ROS的含量极显著地降低(P<0.01);同时极显著地提高了SOD和CAT的活力(P<0.01),极显著地降低了MDA含量与LDH释放率(P<0.01)。(3)实时荧光定量PCR结果显示,H_2O_2能够极显著地降低ZO-1基因的转录量(P<0.01),与模型组比较,HEPs能够极显著的提高ZO-1基因的转录量(P<0.01);Western blot结果显示ZO-1蛋白的表达量与ZO-1基因类似。可见,猴头菇多糖对H_2O_2诱导氧化损伤状态下的IPEC-J2细胞具有保护作用。