慢病毒载体介导Bdnf基因修饰的骨髓间质干细胞移植治疗脑梗死

为研究经Bdnf基因修饰的骨髓间质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)对脑梗死的协同治疗作用,构建带有大鼠Bdnf基因之慢病毒载体,并感染大鼠骨髓间质干细胞(Rat mesenchymal stem cells,rMSCs)。运用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型,经尾静脉注射移植,对照组注射0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)1mL,Bdnf-rMSCs和Mock-rMSCs组分别注射Bdnf-rMSCs细胞悬液以及未插入目的基因的空病毒载体感染后的rMSCs细胞悬液各1mL。各组大鼠分别于术后24h、移植后2周及2月应用modified Neurological Severity Scores(mNSS)评价神经功能状况。结果显示,与对照组相比,Mock-rMSCs及Bdnf-rMSCs移植组神经功能改善明显,mNSS评分差异有统计学意义(P<0.001),而且Bdnf-rMSCs移植组明显优于Mock-rMSCs移植组(P<0.001)。移植后2周及2月,与对照组相比两移植组梗死区脑组织结构恢复较好,均可见EGFP阳性细胞在梗死区及其周边区聚集并存活,并有部分细胞出现神经元样改变。Bdnf-rMSCs移植组中移植细胞大量表达BDNF,两移植组中均有部分植入细胞表达神经细胞表面标志物。研究表明Bdnf基因修饰的rMSCs经静脉移植后可迁移至脑梗死灶周围,向神经细胞分化并长期存活。移植后的干细胞可与其分泌的BDNF协同促进脑梗死后神经功能恢复,这为将来基因工程干细胞移植治疗脑梗死提供了实验依据。

大鼠Bdnf基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

骨髓间质干细胞（MSCs）是目前基因工程正在探讨应用的靶细胞，为构建带有脑源性神经营养因子（Banf）基因慢病毒载体并使其在大鼠骨髓间质干细胞中表达，采用RT-PCR技术获得大鼠Bdnf基因编码区（CDS）片段，限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP，在脂质体介导下与包装质粒HELPER，包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染大鼠MScs（rMSCs）后，PCR和免疫细胞化学法检测在rMSCs中Bdnf基因的插入和表达。结果显示所获的Bdd基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒PNL-BDNF-IRES2-EGFP经鉴定正确。三质粒共转染293T细胞成功，收集、浓缩病毒后测定其滴度为6．7×10^7 TU/mL，PCR证实Bdnf基因插入病毒基因组。感染rMSCs后RT-PCR、免疫细胞化学染色及Western检测各组细胞均有BDNF蛋白表达，其中试验组BDNF-rMSCs更大量表达BDNF，与其余2组（Mock-rMSCs、rMSCs）比较差异具有统计学意义。构建带有Bdnf基因慢病毒载体并在大鼠骨髓间质干细胞中成功表达，为今后基因修饰干细胞的移植后长期观察研究奠定了基础。