植物病毒卫星核酸的研究进展

植物病毒卫星核酸是已知的最小的侵染因子之一,其起源、致病性以及复制机制一直都是研究的热点。目前研究认为,植物病毒卫星核酸最有可能来源于寄主植物基因组或辅助病毒基因组,植物病毒卫星核酸、辅助病毒及寄主三者相互作用对辅助病毒的积累量及寄主病症的发展有调节作用。植物病毒卫星核酸不能自我复制,它们依赖于辅助病毒进行复制,然而,由于结构不同它们的复制方式也不完全相同。自发现以来,这类小的亚病毒分子已成为研究植物细胞中大分子间的互作及其辅助病毒复制机制的简单模型。本文主要总结了植物病毒卫星核酸在复制机制、起源、致病性及应用方面取得的研究进展。

利用酵母双杂交系统研究水稻条纹病毒三个功能蛋白的互作

通过RT—PCR扩增获得水稻条纹病毒（Rice stripe virus，RSV）的CP、SP和NSvc4基因，分别将其与酵母双杂交载体pGADT7和pGBK77相连，构建了重组子pGAD-CP、pGBK—CP、pGAD—SP、pGBK-SP、pGAD．NSnv4、pGBK-NSnv4。利用酵母双杂交系统研究了CP、SP、NSvc4三个蛋白的自激活、蛋白自身以及三个蛋白两两之间的互作情况。结果发现：RSV的CP、SP和NSvc4三个蛋白都不具有自激活现象；CP蛋白自身能够发生互作，SP和NSvc4蛋白未观察到自身互作现象；而CP、SP和NSvc4三个蛋白两两之间也未检测到互作现象的存在。该研究结果初步明确了RSV的CP、SP和NSvc4三个蛋白之间的关系，为追一步研究适三种蛋白的功能及RSV的致病机制奠定了基础。

中国马铃薯Y病毒的检测鉴定及CP基因的分子变异

【目的】查明马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)病在中国的发生情况,及时、准确地鉴定出PVY并对其分子变异进行分析。【方法】采用ELISA方法对采自中国14个省(直辖市)马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行了检测,并对其中的部分材料镜检验证,然后根据CP基因序列设计1对简并引物针对随机选择感染PVY的14个省(直辖市)代表样品进行CP基因扩增克隆,将测序得到的序列进行分子变异分析,并使用贝叶斯法(Bayesian inference,BI)重建系统发育关系。【结果】ELISA检测结果表明,691份样品中220个样品与PVY抗体呈阳性反应,其余呈阴性反应;ELISA检测的阳性材料在透射电镜下均可观察到明显的风轮状内含体,14个PVY分离物均成功扩增出预期大小(约800 bp)的特异性片段,CP基因的核苷酸序列与已报道PVY不同株系的核苷酸序列一致性均在88%以上;在14个PVY分离物CP基因中共发现有29个多态性位点,其中6个简约信息位点,23个单一变异位点。系统发育分析结果显示,14个PVY分离物与PVYN:O株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上,与PVYN:O株系的亲缘关系最近。【结论】PVY CP基因高度保守,但不同地区分离物也存在一定的分子变异,本研究可为今后了解PVY病毒病流行、变异趋势及其防治提供依据。

不同寄主来源的马铃薯Y病毒群体遗传结构的比较分析

文章以马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）P3和pipo基因为分子标记,比较分析烟草和马铃薯两个寄主的PVY遗传多样性和群体分化,并评估突变、选择、基因流等遗传力所起的作用。通过P3和pipo基因计算获得的烟草和马铃薯群体分化指数FST分别为0.116和0.120,且统计检验差异显著,表明烟草和马铃薯寄主的PVY之间中度分化。变异分析结果显示,烟草分离物P3和pipo基因的核苷酸序列一致性分别为85.2%~100%和76.5%~100%,而马铃薯分离物的P3和pipo基因的核苷酸序列一致性分别为95.7%~100%和93.0%~100%,表明烟草PVY变异程度高于马铃薯。同时,P3基因内检测到大量的净化选择位点,表明该基因大部分位点的变异为有害突变,在进化过程中被剔除。此外,P3基因内还检测到两个显著正向选择位点,表明这两个位点的变异为有益突变,有利于病毒的生存竞争。在pipo基因中未检测到显著的选择位点,表明该基因上的变异基本不受自然选择影响。通过P3和pipo基因计算烟草和马铃薯群体间的基因流Nm值分别为1.91和1.83,表明这两个群体间存在较强的基因交流。以上结果表明,来源于烟草和马铃薯寄主的PVY遗传差异显著,突变、自然选择以及基因流都影响两者的遗传多样性及遗传分化程度。

水稻草状矮缩病毒P2基因多克隆抗体的制备及应用

为了进行水稻草状矮缩病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)诊断方法和蛋白功能研究。通过RT-PCR方法从感染RGSV的水稻中克隆该病毒的P2基因,并将此基因片段重组到原核表达载体pDEST17上。将重组载体转化E.coli Rosetta,经IPTG诱导后获得分子量约为29kDa含HIS标签的融合蛋白。以诱导的融合蛋白为抗原,免疫新西兰大耳白兔获得多克隆抗体,经酶联免疫检测发现其效价达到l:8192。并用制备的抗体建立了特异、灵敏的检测RGSV的IC-RT-PCR和Dot-blot ELISA方法,为该病毒的检测、诊断提供了保障,同时也为P2蛋白的结构和功能研究奠定了基础。

应用Real-Time RT-PCR鉴定2个水稻品种(品系)对水稻条纹病毒的抗性差异

应用Real-time RT-PCR检测了水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)在2种水稻品种(品系)武育粳3号和KT95-418的悬浮细胞内复制变化和相对含量的差异,结合传统生物学接种试验,确定了这2个品种(品系)对RSV抗性的差异.结果表明,RSV在武育粳3号的悬浮细胞内24 h达到复制高峰,病毒含量为侵染初期的7.46倍.而在KT95-418的悬浮细胞内,RSV达到复制高峰需要36 h,病毒含量为侵染初期的4.51倍.利用病毒生物学接种的方法,武育粳3号发病率达91.7%,而KT95-418仅为36.0%.由此可见,KT95-418较武育粳3号对RSV具有较高的抗病性.因此,Real-time RT-PCR方法与传统生物学接种试验方法相比,具有更高的准确性和灵敏性,可以作为传统品种抗病性鉴定的验证手段.

中华蜜蜂囊状幼虫病病毒非结构蛋白抗体的制备及其应用

应用Gateway重组技术构建CSBV非结构蛋白,RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)的原核表达载体,将重组表达载体转化大肠杆菌Rosetta,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG)诱导获得RdRp基因原核表达蛋白.以重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备相应的多克隆抗体,Western blot检测表明,该抗体能与RdRp重组蛋白和感病中华蜜蜂幼虫蛋白特异性结合,说明获得的抗体特异性高.利用制备的抗体进行免疫荧光标记,发现其能特异地定位在感病中华蜜蜂血淋巴细胞内.

南方水稻黑条矮缩病毒P6抗体的制备及应用

为了建立快速准确检测田间介体白背飞虱带毒率的方法,利用Gateway重组技术将与病毒早期复制有关的P6基因的N端993 bp构建原核表达载体pDEST17-P6,并将诱导表达的目的蛋白免疫注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果表明:Western blot检测制备的P6抗体可特异性检测SRBSDV侵染水稻的P6蛋白,免疫荧光标记技术可检测南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black streaked dwarf virus,SRBSDV)侵染白背飞虱体内的P6蛋白,且P6抗体可直观高效准确地用于免疫荧光标记检测昆虫带毒率。以上研究表明,所制备的P6抗体可用于SRBSDV的田间介体昆虫带毒率快速检测,有助于病毒病害的监测和预报。

水稻条纹病毒胁迫下的水稻蛋白质组学

采用双向电泳联用MOLDI-TOF-TOF质谱对水稻感病品种武育粳3号和抗病品种KT95-418感染水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)前后的叶片进行蛋白质组学分析。结果显示,RSV基因组编码的病害特异蛋白(disease specificprotein,SP)在武育粳3号中的积累量明显高于KT95-418中。其他25个蛋白经质谱成功鉴定,包括RSV NS2蛋白,寄主中与光合作用、细胞氧化还原状态和离子平衡状态及蛋白的合成、转运与翻译后修饰等相关的蛋白。对这些差异表达的蛋白与水稻感、抗病的作用进行了分析。

RNA干扰途径调控南方水稻黑条矮缩病毒在介体白背飞虱体内的持久侵染

南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)由介体白背飞虱以持久增殖型方式传播,但有关病毒在介体内高效增殖的机制仍不明确.RNA干扰(RNAi)是昆虫保守的抗病毒免疫途径.为了探索SRBSDV在介体白背飞虱体内的持久增殖是否受到RNAi抗病毒免疫途径的调控,本研究采用小分子RNA深度测序发现SRBSDV侵染白背飞虱培养细胞后诱导产生病毒来源的主要长度为21和22 nt的小分子RNA,暗示病毒侵染可激活RNAi反应.在白背飞虱及其培养细胞中通过dsR NA处理干扰RNAi途径中的关键组分Dicer2和Argonaute2基因表达后,SRBSDV的侵染率和积累量显著提高,带毒昆虫的存活率下降、寿命减短.因此,RNAi途径具有调控SRBSDV在介体白背飞虱体内的持久侵染、控制植物病毒在介体昆虫内过度积累从而避免病毒对昆虫造成不利影响的作用.

水稻黑条矮缩病毒在灰飞虱消化系统的侵染和扩散过程

水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)由介体灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)以持久增殖型方式传播,其编码的P9-1蛋白是形成病毒复制和子代病毒粒体装配的场所—病毒原质(viroplasm)的组分之一。为了明确RBSDV在介体昆虫体内的侵染循回过程,本研究通过原核表达的P9-1蛋白免疫注射兔子制备P9-1抗体,应用免疫荧光标记技术研究P9-1在饲毒后不同时期的介体灰飞虱体内的定位。共聚焦显微镜观察到饲毒后3 d,P9-1出现在介体中肠的少数上皮细胞内;饲毒后6 d,在中肠外表的肌肉细胞分布有P9-1;饲毒后10 d,P9-1分布于中肠和后肠表面的肌肉,同时在唾液腺也能观察到P9-1的存在。结果表明RBSDV在介体灰飞虱体内首先侵染中肠上皮细胞并复制,随后扩散到中肠表面的肌肉细胞,并通过环肌和纵肌扩散到中肠和后肠,最后扩散到唾液腺。本研究首次直观地阐述了RBSDV在灰飞虱消化系统的侵染和扩散过程,为有效阻断灰飞虱携带并传播病毒奠定基础。

水稻瘤矮病毒P8蛋白的结构分析及其表达

为揭示水稻瘤矮病毒(RGDV)外层衣壳蛋白P8的结构特点及其在大肠杆菌中的表达特性。利用生物学软件和在线分析工具,对RGDVP8蛋白结构特征进行了生物信息学分析;同时将通过RT-PCR扩增的P8基因克隆到pGEX-4T-1上,构建pGP8转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),在IPTG诱导下表达。利用表达的融合蛋白免疫家兔,制备了抗血清,并以RGDV、水稻矮缩病毒(RDV)、水稻条纹病毒(RSV)、水稻锯齿叶矮缩病毒(RRSV)4种病毒作为供试材料进行特异性检测。分析显示P8蛋白在C端位置有一个典型的跨膜螺旋区,整个蛋白也具有Phytoreo P8家族共有的典型结构域Phytoreo P8 domain。SDS-PAGE和蛋白印记分析表明,RGDVP8融合蛋白分子量约为73kDa,以包涵体的形式获得了高效表达。获得的效价高、特异性强的抗血清,为水稻瘤矮病毒的快速检测及P8蛋白的功能研究奠定了基础。

不同激素及添加物对马铃薯组培苗生长的影响

以马铃薯宾杰(Bintje)品种为试验材料,研究在马铃薯基础培养基中添加不同外源激素及添加物对马铃薯组培苗生长的影响。结果表明,最适于组培苗增殖的激素配比为2.00mg/L6-BA+0.01mg/LNAA,最适于其结薯和生根的激素配比为2.00mg/L6-BA+1.00mg/LNAA。在培养基中添加马铃薯比添加香蕉更有利于马铃薯组培苗叶片的生长,最适添加浓度为100g/L;在培养基中添加香蕉比添加马铃薯更可以促进马铃薯组培苗植株的横向生长,最适添加浓度为50g/L。