水产食物过敏原及其抗原表位的研究进展

近年来食物引起的过敏性疾病发病率持续增高,严重影响了人们的生活质量。水产品是中国主要的致敏性食物,且东部沿海地区过敏发病率较高。已发现的水产食物过敏原有小清蛋白(parvalbumin)、原肌球蛋白(tropomyosin)、精氨酸激酶(arginine kinase)、肌钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein)、肌球蛋白轻链(myosin light chain)、肌钙蛋白C(troponin C)和磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase)等。水产食物过敏反应存在免疫交叉性,过敏原的抗原表位是引发过敏反应的基础,表位组成和空间构型等特征决定了抗原的特异性。本文着重对国内外水产食物过敏原及其抗原表位的研究现状进行了概述,以期为水产食物过敏疾病诊断治疗和低致敏性食品开发提供指导。

鱼类基质金属蛋白酶研究进展

基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)是一类高度保守的生物活性依赖于金属离子的内切酶家族,是参与降解细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)的重要蛋白酶,MMP几乎能降解细胞外基质的所有成分.研究发现,MMPs参与鱼类胶原蛋白的降解,是导致鱼类死后肌肉软化的重要原因.综述了基质金属蛋白酶的分类、结构、调节机制以及它们对鱼类肌肉胶原蛋白的作用.

鲍鱼性腺小肽的制备及抗氧化活性的初步研究

以雄性皱纹盘鲍性腺为原料,建立了蛋白酶酶解制备抗氧化活性蛋白肽的工艺条件.分别对木瓜蛋白酶和中性蛋白酶进行单因素研究,并以二者的复合酶为工具酶进行响应面分析.结果显示,雄性鲍鱼性腺的最优酶解条件为木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的比例为1∶4、pH=6.6、酶解温度为53.7℃、酶解时间为70.4 min.高效液相色谱(HPLC)分析结果表明,酶解液中多肽的分子质量主要分布在1 ku以下.制备的酶解液具有较强的清除自由基效果,清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)的EC50值为6.8 mg/mL,还原力的AC0.5值为12.87 mg/mL.

皱纹盘鲍酶促溶性胶原蛋白的性质研究及抗体制备

针对加工副产物鲍鱼外套膜利用率低的现象,对鲍鱼腹足和外套膜胶原蛋白相关性质进行比较研究,以期为鲍鱼的综合加工提供一定的理论依据。本研究以皱纹盘鲍为原料分别提取得到腹足酶促溶性胶原蛋白(pepsin-soluble collagen of abalone adductor,PSC1)和外套膜酶促溶性胶原蛋白(pepsin-soluble collagen of abalone mantle,PSC2),对PSC1和PSC2相关特性进行比较分析,并利用PSC1制备得到兔抗鲍鱼胶原蛋白多克隆抗体。SDS-PAGE显示,PSC1和PSC2分子组成均为(α1)3,且α1的分子量为140 ku,与水产无脊椎动物Ⅰ型胶原蛋白特征相似。对PSC1进行肽指纹图谱分析,获得6个肽段、含75个氨基酸残基,与盘鲍螺的胶原蛋白前肽α链和欧洲鲍螺的纤维状胶原一致性分别达100%和88%,证明纯化的PSC1为胶原蛋白。氨基酸组成分析表明,PSC1和PSC2的组成基本一致,但脯氨酸和羟脯氨酸含量均低于牛酸溶性胶原蛋白。圆二色谱分析结果显示,PSC1和PSC2溶液均在220和197 nm分别有一正、负峰,具有典型胶原蛋白三股螺旋结构特征。FTIR光谱分析结果提示PSC1和PSC2具有相似的三螺旋结构。利用兔抗皱纹盘鲍PSC1多克隆抗体对皱纹盘鲍、尼罗罗非鱼、鲤和仿刺参胶原蛋白进行免疫印迹分析发现,该抗体只与皱纹盘鲍PSC1和PSC2的α、β和γ链产生反应,表明该抗体具有良好的特异性。

海参内脏胶原降解酶的纯化及性质研究

针对海参自溶现象,研究海参内脏中与胶原降解相关蛋白酶的存在情况,以期了解内源性蛋白酶在海参自溶过程中发挥的作用,为解明自溶的内在机理提供理论依据。通过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析、Sephacryl S-200凝胶过滤柱层析、Phenyl Sepharose FF疏水柱层析及M ini Q离子交换柱层析等方法,从海参内脏中分离纯化出降解明胶的蛋白酶。利用荧光底物研究其酶学性质及其对海参体壁胶原蛋白的降解情况。结果表明,该酶最适温度为30℃,最适p H为7.5,可被金属蛋白酶抑制剂EDTA、EGTA完全抑制,亦可被PM SF、Pefabloc SC等丝氨酸蛋白酶抑制剂完全抑制。底物特异性表明,该酶只对金属蛋白酶荧光底物有分解作用,推测其为金属蛋白酶。该酶在4和37℃下均能有效地分解海参体壁胶原蛋白,表明其在海参自溶过程中起重要作用。

鲍鱼内脏中天然牛磺酸的提取与检测

目的：以皱纹盘鲍内脏为原料,优化高纯度牛磺酸的提取工艺,并建立用高压液相色谱检测牛磺酸纯度的方法。方法经水煮、乙醇抽提、蒸发浓缩、沉淀、活性炭处理、结晶等步骤,获得高纯度天然牛磺酸。用高压液相色谱检测牛磺酸纯度的方法为：色谱柱：Discovery C18；流动相：甲醇-0.05 mol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.3)(v/v,50：50)；流速：1 mL/min；检测波长：330 nm；柱温：室温。结果该提取工艺能从1 kg 鲍鱼内脏中提取得到天然牛磺酸3.07 g。采用该检测方法,牛磺酸的出峰时间为6.037 min,在1~20μg/mL浓度范围内线性关系良好(R2=0.9999),最低检出限为0.03μg/mL,最低定量限为0.12μg/mL,样品测定的平均回收率为99.44%(RSD=0.25%),方法的精密度和稳定性好(RSD<1%),用该方法检测提取得到的牛磺酸纯度为96.06%。采用红外光谱法(IR)对提取得到的鲍鱼内脏牛磺酸进一步作结构鉴定,发现它与标准品的红外特征吸收峰一致。结论获得了高纯度牛磺酸的提取工艺。本方法精密度和稳定性好,回收率高。

杂色蛤中牛磺酸含量与季节变化的关系

旨在探明几种常见海洋经济水产品的牛磺酸含量,特别是杂色蛤（Ruditapes philippinarum）中牛磺酸含量随季节变化的规律.以杂色蛤为原料,制备牛磺酸并利用高压液相色谱法分析牛磺酸的纯度.结果发现,几种常见海洋经济水产品中,杂色蛤体内的牛磺酸含量最高,达8.22 g/kg.以此为原料可制备纯度达92.92%的天然牛磺酸.杂色蛤中牛磺酸含量的季节变化规律为：1—4月牛磺酸含量逐渐升高,4—8月逐渐下降,至8月份达最低点,9月后又逐渐回升,牛磺酸含量介于1784.57-2519.74μg/m L之间.而且,牛磺酸含量的季节变化规律与气温变化基本呈反相关关系.

日本鳗鲡胰蛋白酶的分离纯化及性质分析

通过硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析、Phenyl-Sepharose疏水柱层析、Sephacryl S-200凝胶过滤柱层析等方法,从日本鳗鲡(Anguilla japonica)肝胰腺中分离纯化得到胰蛋白酶,SDS-PAGE显示其分子质量为21.5 ku。以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA为底物,胰蛋白酶最适温度和最适p H值分别为40℃和8.5。动力学实验表明,Km值和kcat值分别为3.1μmol/L和59.9 s-1。丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefabloc SC、PMSF、benzamidine、STI等对其有特异抑制效果。底物特异性结果显示,该酶特异分解Arg和Lys残基的C端。肽质量指纹图谱获得5个片段,共76个氨基酸残基,与基因文库中的日本鳗鲡胰蛋白酶氨基酸序列完全相同。说明本研究所纯化的蛋白质为胰蛋白酶。

鲢小清蛋白的cDNA克隆及在大肠杆菌中的原核表达

以鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌肉cDNA为模板,利用小清蛋白特异性引物进行PCR扩增,克隆得到β小清蛋白两种不同亚型,即Ⅰ型、Ⅱ型编码区基因。将目的基因片段连接到pET28a(+)表达载体,并在大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)]中诱导表达。结果表明,经诱导的小清蛋白重组质粒菌株有特异的蛋白表达。SDS-PAGE分析显示,目的蛋白的分子量约为13 kD,与预期大小一致。菌体超声破碎后发现2种亚型的小清蛋白均为可溶表达。利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,得到高纯度的重组小清蛋白PVⅠ和PVⅡ。经Western Blot鉴定,重组小清蛋白PVⅠ和PVⅡ均能与抗鲢小清蛋白单克隆抗体反应。本研究为进一步分析小清蛋白的结构与致敏性的关系提供了重要的基础。

鲤鱼肌肉Ⅴ型胶原蛋白的分离纯化及其抗体制备

通过酸溶、胃蛋白酶酶解和氯化钠盐析等方法,从鲤鱼肌肉中纯化得到了V型胶原蛋白.SDS-PAGE电泳图谱分析发现,其至少由2条α链(α_1和α_2)组成,其中α1分子质量约为135 ku,α_2分子质量约为120 ku.通过圆二色光谱仪分析其二级结构,发现其具有胶原蛋白三股螺旋结构的典型特征,其热变性温度为30.5℃.将V型胶原蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,成功制备了多克隆抗体.采用免疫印迹法对该多克隆抗体的特异性进行分析,证明其仅与鱼类V型胶原蛋白产生反应,特异性良好.

鲍鱼肌原纤维结合型蛋白酶的初步鉴定

研究了皱纹盘鲍腹足肌肉中肌原纤维结合型蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解作用.SDS-PAGE结果显示,肌原纤维在55～60℃下,肌球蛋白重链（Myosin Heavy Chain,MHC）和副肌球蛋白（Paramyosin,PM）会发生明显的降解.金属蛋白酶抑制剂EDTA、1,10-phenathroline能够有效抑制MHC和PM的分解.EDTA以及丝氨酸蛋白酶抑制剂benzamidine共同作用几乎可完全抑制蛋白质降解,揭示鲍鱼肌肉中存在肌原纤维结合型金属蛋白酶（MetaUoproteinase,MP）和丝氨酸蛋白酶（Serine proteinase,SP）.通过加热、强离子浓度溶液抽提相结合的方式,从肌原纤维蛋白中初步分离出这两种酶.分别利用这两种酶对肌原纤维蛋白进行降解,发现最适温度均在60℃左右,与肌原纤维蛋白自身降解的最适温度（55～60℃）相吻合.对SP的底物特异性分析结果表明,制备的丝氨酸蛋白酶对P1位为Arg残基的荧光底物有较高的分解作用,而对P1位为Lys残基的底物分解较弱.

PVDF超滤膜的制备及其分离大豆蛋白的条件优化

以聚偏氟乙烯(PVDF)为材料,利用浸没沉淀相转化法制备超滤膜,以水通量、孔隙率、截留率等对膜进行表征。结果表明,所制备的膜孔径较均一,在0.7MPa操作压力下,其水通量可达350L/m2·h以上,其孔隙率维持在80%左右,对牛血清白蛋白(BSA)的截留率在90%以上,而对聚乙二醇20000的截留率仅为5%左右。单因素与正交实验结果表明,当温度为50℃、pH=9、操作压力为0.5MPa及料液浓度为240μg/mL,膜的通量最大,对大豆蛋白的截留率可达96.25%。

鲫鱼MBSP的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

构建鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)的原核表达菌株Rosetta(pET28aMBSP),获得重组MBSP,以制备MBSP多克隆抗体。将鲫鱼MBSP全长基因(MBSP)借助表达载体pET-28a构建重组表达菌株Rosetta(pET28a-MBSP),并进行诱导表达后获得重组MBSP。利用Ni-NTA agarose亲和层析柱纯化重组蛋白并进行质谱鉴定。以纯化后的重组MBSP作为抗原免疫新西兰兔,获得MBSP多克隆抗体。分别采用ELISA和Western blot技术测定其效价和特异性。诱导表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析、Western blot检测及质谱鉴定,结果表明该蛋白质为重组MBSP,其相对分子质量约为28×10~3,与天然MBSP大小一致,主要以包涵体形式存在。将其免疫兔子后,从血清中获得了与MBSP发生特异性反应的高效价多克隆抗体。本研究中成功表达和纯化了重组MBSP蛋白,制备了高效价的特异性MBSP多克隆抗体,为MBSP的相关研究奠定基础。

草鱼肌肉脯氨酸内肽酶的研究

脯氨酸内肽酶（Prolylendopeptidase，PEP）是一类能够特异性水解低分子质量多肽链中脯氨酸残基羧基端肽键的内切酶，与胶原蛋白的后期降解有密切关系。以淡水鱼草鱼为原料。采用硫酸铵分级沉淀。DEAE—Sephacel阴离子交换，Phenyl—Sepharose疏水层析和羟基磷灰石层析等方法从草鱼肌肉中分离纯化得到一种脯氨酸内肽酶。SDS—PAGE结果显示，草鱼PEP的分子质量为75ku。酶学性质分析表明，其最适pH为6．0，在pH5．5～7．5间有较好的稳定性。酶的最适温度为30℃，其热稳定性较差。PEP能够特异性分解肽链羧基端为脯氨酸残基的荧光底物，PEP的特异性抑制剂SUAM以及丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟对其有强烈的抑制作用。酶动力学研究表明，草鱼PEP的k为19．23μmol／L，kca为2．5s-1。肽指纹质谱分析结果表明，草鱼PEP与青锵鱼、罗非鱼、斑马鱼PEP的序列同源性分别为98-3％．96．1％和94．4％。

凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂的原核表达及性质研究

通过PCR扩增得到凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPI）基因,将其插入大肠杆菌表达载体p ET-28a,实现丝氨酸蛋白酶抑制剂在BL21（DE3）菌中以包涵体的形式大量表达。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白分子质量约为15 ku,与预期大小一致。将包涵体溶解后,利用Ni2＋亲和柱层析对重组蛋白进行纯化,得到高纯度的重组SPI。经复性后的SPI对胰蛋白酶具有较高的抑制活性。该抑制剂在90℃内加热1 h,可保留90%以上的抑制活性,且在p H 1~8范围内较稳定。该抑制剂能特异性抑制凡纳滨对虾内源性胰蛋白酶的活性。抑制动力学试验结果表明,该抑制剂是竞争性抑制剂,其抑制常数Ki为1.69×10-9mol/L。结论：重组凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶抑制剂具有较高的抑制活性且较稳定,经优化表达条件后有望应用于新型对虾保鲜剂。

蓝圆鲹骨骼肌脯氨酸内肽酶的分离纯化及其对胶原肽的作用

以蓝圆鲹为研究对象,探讨脯氨酸内肽酶（Prolyl endopeptidase,PEP）对鱼类肌肉胶原蛋白的作用及其机理。通过硫酸铵分级盐析,DEAE-Sephacel阴离子交换,Phenyl-Sepharose疏水层析和Q-Sepharose阴离子交换,从蓝圆鲹骨骼肌中分离纯化得到一种脯氨酸内肽酶。SDS-PAGE结果显示,PEP的分子量为82 ku,肽质量指纹图谱分析得到16个肽片段,共169个氨基酸残基。片段序列与墨西哥鲷鱼（Neolamprologus brichardi）PEP的同源性达98.8%,证明纯化得到的酶是PEP。PEP的最适温度为35℃,但热稳定性较差;最适p H为6.0,在p H 5.0~7.5之间有较好的稳定性。将PEP与合成的鱼胶原蛋白小肽反应,利用反相高效液相色谱对产物进行分离,电喷雾质谱分析结果显示PEP的水解位点在脯氨酸残基的羧基端。以上结果表明,鱼类肌肉中的PEP能够协同金属蛋白酶,通过切割脯氨酸残基进一步降解胶原小肽从而参与到鱼肌肉胶原蛋白的新陈代谢中,是鱼死后参与胶原蛋白降解的重要酶类。

利用鲍鱼性腺制备ACE抑制肽

采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步酶解鲍鱼性腺蛋白,以酶解产物分子质量及ACE抑制率为考核指标,用正交试验及响应面分析法对其制备工艺参数进行优化。结果显示,第1步碱性蛋白酶最佳工艺参数为反应p H 8.5,反应温度55℃,加酶量0.5%,酶解时间6 h;第2步木瓜蛋白酶最佳工艺参数为反应p H 6.5,反应温度57℃,酶解时间36 min,加酶量1.5%。将酶解产物用10 ku及3 ku膜超滤,采用凝胶过滤色谱法测得超滤组分中分子质量在1 ku以下的小肽含量为98.5%,IC50为0.44 mg/m L。本研究制备的低分子质量、高活性ACE抑制肽,为鲍鱼加工下脚料的高值化利用提供了理论参考。

鱼糜制品中大豆蛋白检测方法的建立

利用抗大豆胰蛋白酶抑制剂的多克隆抗体建立免疫检测方法,实现对鱼糜制品中大豆蛋白的检测。采用等电点沉淀、硫酸铵盐析、离子交换柱层析等方法纯化大豆胰蛋白酶抑制剂。利用纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂制备抗大豆胰蛋白酶抑制剂多克隆抗体,以蛋白A琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化抗体,采用SDS-PAGE及蛋白质印迹法分别对其进行纯度及特异性分析。以制备的多克隆抗体为基础,通过蛋白质印迹、竞争性酶联免疫吸附试验分析鱼糜制品中大豆蛋白的存在情况。结果表明,制备的抗大豆胰蛋白酶抑制剂多克隆抗体纯度较高,只与大豆分离蛋白中的大豆胰蛋白酶抑制剂反应,特异性良好。以抗大豆胰蛋白酶抑制剂多克隆抗体建立的蛋白质印迹法及竞争性酶联免疫吸附试验检测市售的鱼糜制品,结果千叶豆腐中大豆胰蛋白酶抑制剂的含量最高,其次为香菇鱼丸。本研究建立的大豆胰蛋白酶抑制剂免疫检测方法,可实现对鱼糜制品中大豆蛋白的半定量检测。

大肠埃希菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸

目的为大规模工业化生产S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)提供一套经济合理的生产工艺。方法将经DNA序列测定正确的SAM合成酶基因(SAMS)片段,经Eco RⅠ和NotⅠ双酶切,亚克隆至大肠埃希菌表达载体p ET-28a上,构建SAMS基因重组表达质粒p ET-28a-SAMS。将重组表达质粒转入大肠埃希菌表达宿主BL21(DE3),构建大肠埃希菌表达菌株BL21(p ET-28a-SAMS)。采用混合悬浮培养法,利用含有SAMS基因的重组大肠埃希菌BL21(p ET-28a-SAMS)中的SAM合成酶系和酿酒酵母JM-310中的ATP生物合成酶系,构建一个以葡萄糖为能源的中间偶合ATP再生系统,并对两种细胞的偶联合成比例、偶联时间、通透剂的种类及浓度、偶联缓冲液主要成分的浓度进行优化。结果经双酶切及菌落PCR鉴定证明,重组表达质粒p ET-28a-SAMS及大肠埃希菌表达菌株BL21(p ET-28a-SAMS)构建正确。大肠埃希菌BL21(p ET-28a-SAMS)与酿酒酵母的最佳偶联合成比例为4∶1,最佳偶联时间为5 h,添加5%甲苯通透效果最好,200 mmol/L磷酸缓冲液、200 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L腺苷、30 mmol/L Mg Cl2·6H2O、30 mmol/L L-甲硫氨酸为最适偶联缓冲体系。最佳偶联条件下,偶联系统中SAM的浓度最高达1.7 g/L,对照组中SAM的浓度为0.17 g/L。结论本研究建立的方法操作方便,工艺简单,为SAM的廉价生产提供了一条新的途径。