T-exo负载DC诱导抗肝癌细胞免疫效应研究

目的：观察肝癌细胞来源的外泌体（T-exo）负载DC体外诱导细胞毒T细胞（CTL）对肝癌细胞的杀伤作用。方法：采用超滤离心技术联合蔗糖密度梯度超速离心的方法从肝癌Huh-7细胞培养上清液中分离外泌体（T-exo）,透射电镜鉴定形态,Western blot检测外泌体相关蛋白CD9、CD63、HSP70及肿瘤抗原分子AFP的表达;分离健康供者外周血单个核细胞（PBMC）培养DC,流式细胞术鉴定负载T-exo的DC细胞表型;用2-（4-碘苯）-3-（4硝基苯）-5-（2,4-磺苯基四氮唑）-2H-四唑单钠盐-1（WST-1）法检测负载T-exo的DC刺激T淋巴细胞增殖情况;流式细胞术Annexin-V/PI双染法检测负载T-exo的DC诱导CTL分别对AFP阳性Huh-7细胞及AFP阴性的SMMC7721细胞的杀伤作用。结果：透射电镜下可见T-exo为圆形或椭圆形双层膜囊泡状小体,大小不等,平均直径50～100 nm,表达外泌体膜相关分子及肿瘤抗原分子。负载T-exo的DC可促进初始T细胞增殖,T-exo致敏DC对AFP阳性的Huh-7肝癌细胞系杀伤活性明显高于AFP阴性的SMMC7721肝癌细胞组（P〈0.05）及未负载T-exo的对照组DC（P〈0.05）。结论：负载T-exo的DC能促进T细胞增殖,提高CTL细胞的细胞毒活性诱导特异性的抗肝癌效应。经T-exo抗原致敏DC诱导的CTL对肝癌细胞有明显的细胞毒作用,明显高于DC对照组（P〈0.05）。

NKG2D配体在中晚期食管癌患者术后NK细胞免疫治疗中的作用

目的:探讨NKG2D配体MHC-I类相关分子A(MHC class I-related molecules A,MICA)在中晚期食管癌患者术后化疗联合NK细胞免疫治疗中的作用。方法:福建省肿瘤医院90例中晚期食管癌患者手术后,分为单纯化疗组40例、化疗联合NK细胞治疗MCIA阴性组(简称MICA-组)25例及化疗联合NK细胞治疗MICA阳性组(简称MICA+组)25例,比较其疗效。结果:与单纯化疗组及MICA-组相比,MICA+组CD3+、CD4+T细胞阳性率、NK细胞阳性率及CD4+/CD8+比率明显高于治疗前[(64.2±6.4)%vs(51.3±5.6)%,(39.8±8.2)%vs(29.5±3.2)%,(25.3±2.1)%vs(16.4±4.3)%,(1.4±0.5)vs(1.1±0.7);均P<0.05],T-reg细胞明显低于治疗前[(6.3±4.5)%vs(17.3±2.4)%,P<0.05]。3组疾病控制率及有效率无明显差异(P>0.05)。MICA+组KPS评分治疗后明显提高,MICA+组能明显改善化疗引起的白细胞减少、外周神经毒性症状,MICA+组疾病进展时间(time to progression,TTP)及总体生存时间(overall survival,OS)均明显延长(均P<0.05)。但单纯化疗组及MICA-组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:食管癌组织MICA表达阳性的中晚期患者进行化疗联合自体NK细胞能有效能有效提高免疫力,改善患者生活质量,并能延长生存期,且回输安全、不良反应小。

肝癌切除肝缺血再灌注损伤前后的蛋白质组学变化

背景:肝癌切除肝缺血再灌注损伤可促进微小转移灶的侵袭转移并引起线粒体损伤。目的:比较肝癌切除手术过程中肝正常组织缺血再灌注损伤前后蛋白质表达谱的改变,筛查发生肝缺血再灌注损伤应激的相关蛋白质分子标志物并探讨可能机制。方法:应用双向等电聚焦/聚丙烯酰胺凝胶电泳建立20例肝癌切除患者肝缺血再灌注前与灌注后15min肝正常组织的全细胞蛋白质和线粒体蛋白质表达图谱,并进行差异分析,应用基质辅助激光解吸离子化串联时间质谱对差异蛋白质点进行鉴定,并进行生物信息学分析。结果与结论:相同条件下对各组全细胞和线粒体蛋白样品分别进行3次双向电泳,筛选在3次电泳中均存在的差异点进行分析,在全细胞蛋白质图谱中共鉴定出5个差异蛋白,在线粒体蛋白质图谱中未鉴定出明显的差异蛋白。结果可见肝癌切除手术过程中肝缺血再灌注15min即可使细胞骨架蛋白、热休克蛋白等细胞保护蛋白表达发生改变,同时有促进肿瘤转移的风险,需要采取预防措施降低影响,但线粒体蛋白表达基本未发生改变。

探讨地西他滨短时刺激对RAK细胞免疫表型及抗癌活性的影响

目的:探讨地西他滨(DAC)对重组人纤维连接蛋白活化杀伤细胞(RAK)增殖、免疫表型及抗肝癌效应的影响。方法:采用RetroNectin、CD3单抗及rhIL-2诱导外周血单个核细胞以培养RAK细胞,培养第1天加入不同浓度的DAC(0、50、500、1 000、2 000、3 000 nmol/L)刺激24 h后,全量换液。培养第4、7、10、12天,采用血球计数仪进行细胞计数,CFSE检测细胞增殖水平;流式细胞术检测不同培养时间各浓度DAC刺激的RAK细胞的免疫表型;Annexin-Ⅴ/PI检测细胞凋亡水平;以CD107a、IFN-γ、穿孔素、颗粒酶-B表达水平评估各组RAK细胞的抗肝癌效应。结果:随着培养时间延长,DAC浓度越高,细胞增殖抑制越明显(P<0.05)。与对照组相比,DAC短时刺激的RAK细胞在培养10 d后,高浓度DAC组(≥1 000 nmol/L)RAK细胞CD4比例显著增加,CD8比例及CD4+和CD8+的中央记忆细胞(TCM)比例呈下降趋势(P<0.05)。培养第12天NKT水平显著升高(P<0.05),随着DAC浓度增高细胞凋亡水平显著升高(P<0.05)。与其他DAC浓度组相比,1 000 nmol/L DAC刺激组CD107a、IFN-γ、穿孔素表达显著升高(P<0.05)。结论:RAK细胞经1 000 nmol/L DAC短时刺激后,可提高CD4、CD4+TCM及NKT比例,增强对肝癌细胞的细胞毒效应。

肝细胞肝癌组织浸润性淋巴细胞及其因子的表达

目的:分析原发性肝细胞癌(HCC)组织中浸润淋巴细胞的分类及细胞因子表达,探讨肝癌组织免疫微环境改变的意义。方法:收集76例原发性HCC的癌组织及非癌组织标本,应用流式细胞术及免疫组化的方法分别检测组织中免疫细胞的比例;运用流式微球阵列法(CBA)检测HCC组织和非癌组织中Th1/Th2类细胞因子,ELISA法检测TGF-1、VEGF的表达。结果:HCC患者中CD3+T细胞、CD4+Th细胞、Treg细胞及CD45RO+记忆性T细胞在癌组织中的比例均高于相应的非癌组织,而CD8+CTL细胞在癌组织中的比例较低;Treg细胞与Th细胞或CTL细胞水平呈负相关;癌组织中早期活化因子CD69在CD3+T淋巴细胞及NK细胞上的表达均低于非癌组织,而癌组织中晚期活化因子HLA-DR在CD3+T细胞表达的水平高于非癌组织。细胞因子IL-10、TGF-1及VEGF在癌组织中表达高于非癌组织。结论:肝癌组织微环境中,抗肿瘤效应性细胞比例下降,而抑制性细胞及其相关因子增加,引发肿瘤浸润淋巴细胞的免疫无能,导致肿瘤发生。

乙型肝炎病毒X蛋白通过DNMT3A诱导肝癌细胞RUNX3基因高甲基化

目的研究肝癌细胞中乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对抑癌基因Runt相关转录因子3(RUNX3)表达的影响及相关作用机制,探讨乙肝病毒促肝癌发生的表观遗传调控。方法HBx重组表达载体转染5-aza-CdR处理或未处理的Huh7、HepG2肝癌细胞,Western Blot及RT-qPCR检测RUNX3的表达,分析RUNX3基因启动子CpG岛甲基化水平。合成DNA甲基转移酶3A的小干扰RNA(siRNA_3A)单独转染或与HBx共转染,检测RUNX3的表达。PCR检测21例手术切除的肝细胞癌新鲜组织标本HBx表达情况,比较HBx阴性与HBx阳性组织样本间RUNX3的表达差异以及启动子甲基化程度。结果过表达HBx可导致肝癌细胞内RUNX3表达下调,且甲基转移酶抑制剂5-aza-CdR可完全阻断HBx对RUNX3的抑制作用。HBx诱导RUNX3基因启动子CpG岛发生高甲基化,但不影响DNA甲基转移酶的表达。siRNA_3A转染肝癌细胞后,RUNX3 mRNA与蛋白表达均显著上调;其与HBx共转染后,逆转了单独HBx对RUNX3的抑制作用。HBx阳性的肝癌组织中RUNX3mRNA表达水平较HBx阴性组低,且RUNX3启动子甲基化程度也相对较高。结论 HBx通过促进RUNX3启动子区域发生高甲基化而抑制其表达,且这一过程是由DNMT3A所介导的。

DC/CIK维持治疗晚期非小细胞肺癌的临床观察

目的：评价树突状细胞联合自体细胞因子诱导杀伤细胞（ DC/CIK）维持治疗晚期非小细胞肺癌（ NSCLC）的疗效和不良反应。方法根据治疗情况将2010年1月至2014年1月120例含铂方案化疗4～6个周期后疾病稳定的晚期NSCLC患者分为对照组（ n＝65）和研究组（ n＝55），仅研究组化疗后接受DC/CIK维持治疗。对两组进行生存随访并比较中位无进展生存期（ PFS）和总生存期（ OS），同时记录不良反应情况。结果研究组的中位PFS为5．0个月，高于对照组的3．5个月，差异有统计学意义（P＜0．05）；研究组的中位OS为8．5个月，与对照组（8．0个月）的差异无统计学意义（P＞0．05）；两组化疗后获不同疗效亚组中位PFS和OS的差异均无统计学意义（ P＞0．05）。常见不良反应为骨髓抑制、发热、乏力和关节酸痛，两组不良反应发生率的差异无统计学意义（ P＞0．05）。结论 DC/CIK维持治疗可延长化疗后疾病稳定晚期NSCLC患者的进展时间，且不良反应轻，患者可耐受。

围手术期成分输血对食管癌患者CD_4^+CD_(25)^+CD_(127)^(dim/-)Treg细胞的影响

目的探讨围手术期成分输血对食管癌患者CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞的影响,为临床合理输血提供实验依据。方法收集2011年7月至2012年5月期间食管癌根治手术患者50例,按围手术期输血与否及输血成分分为A、B、C、D、E 5组,每组10例:A组围手术期不输血,B组围手术期输入异体滤白悬浮红细胞,C组围手术期输异体悬浮红细胞,D组围手术期输异体滤白新鲜冰冻血浆,E组围手术期输异体新鲜冰冻血浆,另选10例健康人作为对照。分别于手术前、术后2、5、10d外周静脉采血。采用鼠抗人单克隆抗体CD4-FITC/CD25-PECy5/CD127-PE标记Treg细胞,经流式细胞仪检测,Treg细胞比例以CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞/CD4+T百分率表示。结果 A、B、D组术后2dTreg细胞比例开始增加,至术后5～10d恢复到术前水平。C、E组术后2dTreg细胞比例增加,至术后10d仍未恢复正常,且C、E组术后各时间段Treg细胞比例均分别高于B和D组(P<0.05)。结论围手术期滤白细胞输血对食管癌患者术后免疫功能无显著影响,输非滤白成分血可造成一定程度的免疫抑制。

Grb2的抑制对K562细胞侵袭和迁移能力的影响

目的探讨Grb2的抑制对K562细胞侵袭和迁移能力的影响。方法 pSilence-4.1CMV-Grb2原核表达载体的构建并应用脂质体介导法将其转染至人慢性髓细胞性白血病细胞K562,后以潮霉素筛选稳定表达siRNA的细胞克隆。应用Western blot和RT-PCR技术,检测转染Grb2siRNA重组质粒的K562细胞(K562/pSilence-4.1CMV-Grb2)、转染空载体细胞(K562/pSilence-4.1CMV)和未转染细胞(K562)中Grb2的表达情况。Transwell小室体外迁移和侵袭能力实验测定各组细胞的迁移和侵袭能力。结果成功构建了pSilence-4.1CMV-Grb2原核表达载体,并获得稳定表达siRNA原核载体的细胞株K562/pSilence-4.1CMV-Grb2/405、K562/pSilence-4.1CMV-Grb2/541及K562/pSilence-4.1CMV-Grb2/215;与其他组比较,K562/pSilence-4.1CMV-Grb2/405细胞Grb2mRNA和蛋白的表达水平显著降低并伴随着其迁移和侵袭能力的下降。结论 Grb2的抑制可明显降低K562细胞侵袭和迁移能力。提示针对Grb2的siRNA有望成为抑制肿瘤转移的基因治疗的一种新途径。

Grb2-SH3抑制剂peptidimer-c对K562细胞凋亡相关基因表达的影响

目的分析peptidimer-c对K562细胞基因表达谱的影响，初步探讨peptidimer-c诱导K562细胞凋亡和抑制生长的可能机制。方法应用锥虫蓝染色法计数经不同浓度peptidimer-c分别作用不同时间后的K562活细胞数；通过透射电子显微镜观察peptidimer-c作用前后K562细胞的超微结构；应用HumanU133Plus3．0基因表达谱芯片检测peptidimer-c作用前后K562细胞的差异表达基因；并用反转录聚合酶链反应（RT．PCR）验证芯片结果。结果peptidimer-c能诱导K562细胞凋亡和抑制生长，peptidimer-c作用于K562细胞后引起大量基因表达的变化，差异表达基因有529个，其中上调455个，下调74个，影响细胞凋亡的基因包括JUN、AXUDl、TNFRSFIOB等表达明显上调；RT-PCR验证选取的15个基因的表达差异与芯片结果一致。结论peptidimer-c可通过上调肿瘤坏死因子及其受体家族成员和JUN家族，启动K562细胞凋亡。

蛋白质谱技术预测大鼠心脏移植后急性排斥反应

目的探讨蛋白质谱技术对大鼠心脏移植后急性排斥反应的预测。方法建立颈部异位异种大鼠心脏移植模型。（1）急性排斥A和B组，供受体不作预处理。（2）治疗A和B组，受体术前1d腹腔注射环孢素A（CsA）20mg／kg，术后每天10mg／kg。A和B组分别在术后5d和7d取血液标本及移植物（供心）标本。（3）空白组，取大鼠移植前血液及心肌组织作标本。应用蛋白质谱技术对各组的血清及心肌组织蛋白质样本进行质谱测定，统计分析各组之间的差异蛋白质，并比较分析差异蛋白质的峰强度。结果与空白组血清比较，急性排斥A组与之存在7个差异蛋白质峰，急性排斥B组与之存在11个差异蛋白质峰。急性排斥A组与治疗A组比较，有4个差异蛋白质峰，急性排斥B组与治疗B组比较，有6个差异蛋白质峰。与空白组心肌组织蛋白质比较，急性排斥A和B组与之分别存在7个和13个差异蛋白质峰。以上比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常与急性排斥反应后不同时相点血清及心肌组织中的蛋白存在明显差异，这种差异蛋白可能与急性排斥反应相关。