乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白HBSP与TGFβ1诱导蛋白1相互作用促进TGFβ1诱导的肝癌细胞上皮间质转化

目的探讨乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白(Hepatitis B spliced protein,HBSP)与转化生长因子1诱导蛋白1(transforming growth factor-β1-induced transcript 1,TGFβ1I1)相互作用对TGFβ1诱导的肝癌细胞上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)的影响。方法构建HBSP慢病毒表达载体,利用293T细胞包装慢病毒颗粒,感染Huh7肝癌细胞株。以5ng/mLTGFβ1分别诱导稳定表达HBSP的慢病毒细胞株及其对照细胞株,观察细胞形态的变化,并提取细胞蛋白,Westernblot检测上皮间质转化标志物E-钙黏素(E-cadherin,E-cad)、紧密连接蛋白(Claudin-1)、β-链蛋白(β-catenin)、N-钙黏素(N-cadherin,N-cad)的变化。进而以TGFβ1I1特异性siRNA转染上述细胞,Westernblot观察以上指标变化情况。最后以侵袭小室实验和划痕实验分别检测TGFβ1诱导的细胞侵袭与迁移能力的变化。结果筛选获得稳定表达HBSP的慢病毒细胞株Huh7-HBSP-flag-HIV及其对照细胞株Huh7-flag-HIV。以TGFβ1诱导后在显微镜下观察到细胞形态由紧密的上皮形态变为松散的间质形态;特异性抗体检测表明上皮标志物E-cad、Claudin-1、β-catenin表达量下降,而间质标志物N-cad表达上升。侵袭小室实验和划痕实验表明TGFβ1诱导的HBSP表达株侵袭及迁移能力增强。而转染TGFβ1I1特异性siRNA可逆转以上现象。结论 HBSP与TGFβ1I1相互作用可促进TGFβ1诱导的肝癌细胞上皮间质转化并增强其侵袭迁移能力,提示HBSP在HBV相关性肝细胞肝癌发生发展中具有重要的致病意义。

乙型肝炎病毒对人肝癌细胞脂类代谢相关蛋白表达的影响

目的从mRNA水平和蛋白水平检测乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)对人肝癌细胞脂类代谢相关蛋白表达的影响。方法以HBV细胞株或以1.2倍体HBV基因组瞬时转染人肝癌细胞株,采用实时定量PCR和Western blot方法验证人肝癌细胞载脂蛋白AI(apolipoprotein A-I,ApoAI)、载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD 2)、NADPH脱氢酶(醌)1(NAD(P)H dehydrogenase,quinone 1,NQO 1),以及肝型脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein 1,FABP 1)和乙酰辅酶A乙酰转移酶2(acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2,ACAT 2)等脂类代谢相关蛋白表达水平的改变。结果 HBV细胞株或瞬时转染HBV均使人肝癌细胞SOD 2、NQO 1基因的mRNA和蛋白表达量下调,FABP 1基因的mRNA和蛋白表达量上调。结论 HBV可影响人肝癌细胞脂类代谢相关蛋白表达,为HBV致肝细胞脂肪变机制的深入研究打下良好基础。

微囊藻毒素-LR对小鼠原代肝细胞线粒体功能的影响

目的蓝藻水华引起的微囊藻毒素污染是世界性关注话题之一,微囊藻毒素LR(MC-LR)具有强特异性肝毒性,但其引起肝损伤的确切机制尚未完全阐明。为解决这一问题,本研究从细胞分子层面探讨MC-LR造成肝细胞线粒体功能改变的分子机制。方法提取小鼠原代肝细胞,加入梯度剂量的MC-LR(2.5~10 nmol/L)作用48 h,以未加毒素处理组为对照,检测MC-LR对线粒体功能的影响(包括ATP水平和线粒体膜电位检测),DNA损伤(包括彗星试验和8-OHdG水平检测),并分析p53抑制剂pft-α作用下线粒体功能损伤情况。结果 MC-LR造成肝细胞线粒体功能障碍,DNA损伤且p53蛋白表达水平上调;p53特异性抑制剂pft-α减轻MC-LR造成的线粒体损伤。结论在本试验条件下,MC-LR造成小鼠肝细胞线粒体功能异常的机制与其造成DNA损伤诱导p53上调有关。

乙型肝炎病毒剪接蛋白HBSP与泛转录表达因子剪接变异体1相互作用增强NF-κB活性

目的探讨乙型肝炎病毒剪接蛋白HBSP与泛转录表达因子剪接变异体1(Ubiquitously expressed transcript splice variant 1,UXT-V1)相互作用及其对NF-κB活性的影响。方法通过酵母双杂交(yeast two hybrid assay)、免疫共沉淀、激光共聚焦、哺乳动物双杂交、GST-Pulldown实验检验HBSP与UXT-V1的相互作用。以NF-κB启动子驱动的报告基因载体转染UXT-V1沉默的HBSP稳定表达细胞株,检测报告基因的变化。结果 UXT-V1与HBSP在酵母内具有相互作用,进一步验证表明,在哺乳动物细胞内外HBSP与UXT-V1均存在相互作用。HBSP能增强NF-κB活性,该效应与HBSPUXT-V1相互作用有关。结论 HBSP与UXT-V1相互作用促进肝细胞NF-κB通路的激活,可能对HBV相关性肝脏疾病的发生发展产生影响。

乙型肝炎病毒通过抑制AGE-Rs表达促进AGEs诱导的肝癌细胞增殖

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)对晚期糖基化终产物受体(AGE-Rs)表达及AGEs诱导下肝癌细胞增殖的影响。方法利用HepG2.2.15细胞或肝癌细胞HepG2瞬时转染1.2倍HBV基因组,采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹法(Western-blot),从mRNA水平和蛋白水平检测HBV对AGE-Rs表达的影响。使用AGEs(100μg/mL)处理细胞,采用CCK-8法比较HepG2和HepG2.2.15细胞在AGEs诱导下的增殖情况。结果在HepG2.2.15细胞或瞬时转染HBV的HepG2细胞中,AGE-R1和AGE-R3的mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05),而AGE-R2表达水平无变化。细胞增殖实验表明,在AGEs诱导下,HepG2.2.15细胞的增殖能力强于HepG2细胞(P<0.05)。结论HBV可以抑制肝癌细胞AGE-R1和AGE-R3的表达,并促进AGEs诱导下肝癌细胞的增殖。

幽门螺杆菌CagA与YWHAE互作区段的确定

目的探讨幽门螺杆菌CagA蛋白与宿主细胞YWHAE蛋白相互作用的区段。方法先在酵母细胞水平构建CagA区段蛋白[-N、-M、-(N+M)、-C]的表达载体,经“滤纸法”检测、一对一交配试验及“ONPG液相法”分析,筛选互作区段;进而在哺乳动物细胞水平,选用Cos7细胞经共转染、Co-IP方法确定互作区段,选用AGS细胞经上调/下调YWHAE表达、共转染、双荧光素酶报告基因检测等分析细胞NF-κB活性检测CagA候选区段与YWHAE互作的功能。结果成功构建CagA蛋白的N、M、(N+M)和C区段的酵母表达载体,CagA各区段蛋白“滤纸法”检测反式激活特性均为阴性,“一对一”交配后“液相法”筛选到CagA区段[-N、-(N+M)、-C]分别可与YWHAE在酵母中相互作用;Cos7细胞实验确定CagA区段[-N、-C]可分别沉淀外源性YWHAE,AGS细胞中CagA区段[-N、-C]对细胞NF-κB的激活,上调YWHAE能增强、下调YWHAE则抑制。结论幽门螺杆菌CagA蛋白N-末端与C-末端均分别与宿主细胞YWHAE蛋白相互作用,并可激活细胞NF-κB。

蛋白质磷酸酶4催化亚基调控乙型肝炎病毒X蛋白水平及生物学功能

目的探讨蛋白质磷酸酶4催化亚基(protein phosphatase 4 catalytic subunit,PP4C)对乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)在蛋白质水平的调控及生物学功能的影响,为乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关性肝癌提供潜在治疗靶点。方法通过免疫共沉淀(co-immunopreciptation,Co-IP)与GST pull-down试验验证HBx与PP4C在体内与体外的相互作用。采用Lipofectamine 3000试剂转染PP4C过表达真核质粒检测PP4C对HBx在蛋白质水平的影响,并用蛋白质合成抑制剂环己酮亚胺(cycloheximide,CHX)处理过表达PP4C的肝癌细胞,Western blot检测HBx半衰期变化。磷酸化试验检测PP4C对HBx磷酸化水平的影响。CCK8增殖、细胞划痕、Matrigel侵袭小室试验检测PP4C对HBx生物学功能的影响。结果Co-IP与GST pull-down试验证实HBx与PP4C在肝癌细胞内存在相互作用,在体外也存在相互作用。肝癌细胞中过表达PP4C可提高HBx蛋白水平,并明显延长HBx半衰期。磷酸化试验证实在肝癌细胞中过表达PP4C可降低HBx丝氨酸磷酸化水平。PP4C过表达对肝癌细胞的增殖没有影响,但是促进肝癌细胞的迁移与侵袭能力。结论HBx与PP4C的相互作用可提高HBx稳定性,最终促进肝癌细胞的迁移与侵袭,其机制与PP4C降低HBx丝氨酸磷酸化水平有关。本研究为发现HBx致病新机制提供理论依据,以PP4C和HBx蛋白相互作用为靶标,有望为HBV感染相关肝脏疾病的治疗提供有益思路。

HBV转基因小鼠肝原代细胞分离纯化及其在肝损伤研究中的应用

目的分离鉴定乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠肝原代细胞,为HBV体外相关研究提供有利模型。方法HBV转基因C57 BL/6小鼠深度麻醉后,通过二步灌注法,首先用不含钙灌注液将肝中的血液冲洗干净,然后用含钙的IV型胶原缓冲液将肝细胞消化下,通过3次低速低温离心法纯化去除杂质,则成功分离提取肝原代细胞。进而通过糖原染色法对提取的细胞进行鉴定,并检测7 d内肝细胞的增殖活力,以及第1天和第3天细胞凋亡情况。最后,将提取的肝细胞应用于过氧化氢诱导肝细胞损伤表型检测,包括细胞内活性氧、线粒体膜电位、多个氧化应激因子转录水平检测和LDH泄露情况。结果(1)分离的HBV小鼠肝原代细胞为典型性肝细胞形态,并呈现糖原阳性染色结果;(2)肝细胞活性检测发现肝细胞贴壁后,活性增强,第5~6天时活性最高,然后逐渐下降;(3)对比肝细胞提取后第1天和第3天的细胞死亡情况,未发生明显自发性死亡;(4)细胞通过过氧化氢诱导后,发现胞内活性氧积聚,线粒体膜电位改变,氧化应激因子转录水平上调,以及乳酸脱氢酶泄露增加。结论在本实验条件下,成功分离鉴定HBV小鼠肝原代细胞,并应用于肝损伤相关实验。

乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白致HepG2细胞凋亡的蛋白质组学分析

目的 研究乙型肝炎病毒（hepatitits B virus,HBV）表面抗原大蛋白（large envelope protein,LHB）对HepG2细胞凋亡的影响,并以蛋白质组学方法探讨其机制.方法 以腺病毒表达载体pShuttle-IRES-hrGFP-1克隆HBV LHB基因,经重组、包装后获得重组腺病毒Ad-LHB,与空载体重组腺病毒Ad-GFP分别感染HepG2细胞,采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、JC-1细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒和碘化丙啶（PI）染色检测细胞凋亡情况.Ad-LHB及Ad-GFP分别感染HepG2细胞,提取细胞总蛋白,各取600μg蛋白样品进行双相电泳,R350染色,以双相电泳图像分析软件ImageMaster 2D Platinum确定差异蛋白点,Ettan斑点自动挖胶系统切取差异蛋白,脱色酶解后进行MALDI-TOF-TOF MS鉴定并分析.结果 Ad-LHB感染导致HepG2细胞凋亡明显增加.双向电泳及扫描分析显示Ad-LHB与Ad-GFP感染的HepG2细胞共有39个蛋白差异.质谱分析并确定其中的33种共36个蛋白,这些差异蛋白质有9种与细胞凋亡密切相关,其中,CAPN2、eIF3K和PPP2CB在Ad-LHB感染HepG2细胞表达增高,SERPINH1、LASP1、PRDX1、DHRS2、LDHA和PSMA4在Ad-LHB感染HepG2细胞表达降低.结论 HBV LHB可致HepG2细胞凋亡,多种细胞凋亡相关蛋白参与此过程.

含MPN结构域蛋白(MPND)通过上调乙型肝炎病毒X蛋白水平影响其功能

乙型肝炎病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)在生成后即被快速降解,但目前影响HBx稳定性的机制仍未完全阐明。课题组前期通过酵母双杂交筛选与HBx具有相互作用的去泛素化酶(Deubiqutinases,DUBs),含MPN结构域蛋白(MPN domain containing protein,MPND)为筛选获得的蛋白之一。本研究首先采用免疫共沉淀和激光共聚焦实验验证HBx与MPND的相互作用,并通过酵母双杂交实验进一步分析两者相互作用的区域。Western blot检测过表达MPND的肝癌细胞中HBx蛋白水平的变化。以蛋白合成抑制剂环己酮亚胺(Cycloheximide,CHX)或蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,检测MPND对HBx蛋白半衰期及降解途径的影响。通过泛素化实验分析MPND对HBx泛素化水平的影响。采用双荧光素酶报告基因检测实验和克隆形成实验检测MPND对HBx生物学功能的影响。结果显示,MPND与HBx在肝癌细胞内存在相互作用,且HBx的26~50和81~120位氨基酸与MPND的272~362位氨基酸介导HBx与MPND的结合;过表达MPND的肝癌细胞中,HBx蛋白水平显著增高,HBx的半衰期明显延长,且蛋白酶体抑制剂处理后,MPND对HBx蛋白降解的抑制效果更为显著,但HBx泛素化水平没有变化;共表达MPND与HBx的肝癌细胞中,MPND通过上调HBx蛋白水平,进而促进了HBx对NF-κB启动子的反式激活作用,且进一步抑制克隆形成。本研究表明,MPND通过泛素非依赖-蛋白酶体途径抑制HBx降解,从而增加HBx蛋白水平,调控HBx功能,可能参与HBV致病机制,以此蛋白相互作用为靶标,将为HBV感染相关肝脏疾病的治疗提供有益思路。

幽门螺杆菌促肝细胞增殖及分子机制的初步研究

目的研究幽门螺杆菌(Hp)对肝细胞增殖的影响并探讨其分子机制。方法以不同量的Hp标准株NCTC11637与HepG2肝细胞共培养,CCK-8法检测细胞的增殖情况并确定最佳Hp作用剂量。用Affymetrix人类基因表达谱芯片检测Hp与HepG2共培养对HepG2细胞基因表达谱的影响,并选取5个差异表达基因以半定量RT-PCR技术验证。结果 MOI比值(细菌与细胞个数比)在0.15∶1～0.075∶1时,Hp对HepG2细胞具有明显的促增殖作用;HepG2细胞经MOI比值为0.15∶1Hp处理后有35个基因转录发生变化:ICAM-1等19个基因上调,SLC38A4等16个基因下调,这些变化基因涉及细胞骨架/基质、DNA结合蛋白及转录因子等;5个基因表达情况与表达谱芯片检测结果完全吻合。结论一定剂量的幽门螺杆菌可促进肝细胞增殖,这与Hp导致HepG2细胞基因转录调控有关基因的表达变化有关。

泛素特异性肽酶22调控乙型肝炎病毒X蛋白水平及功能

目的探究泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase 22,USP22)与乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)相互作用对HBx蛋白水平及其生物学功能的影响。方法通过GST pull-down、免疫共沉淀以及激光共聚焦试验检测HBx与USP22的相互作用。瞬时转染USP22真核表达质粒或干扰USP22表达的siRNA,Western blot检测肝细胞中HBx蛋白表达水平的变化。以环己酰亚胺(cycloheximide,CHX)、蛋白酶体抑制剂MG132(carbobenzoxy-Leu-Leu-leucinal,MG132)分别处理转染后的细胞,检测HBx蛋白的降解速率。进一步通过细胞内泛素化试验检测USP22对HBx泛素化的影响,明确USP22影响HBx蛋白稳定性的具体机制。最后,以双荧光素酶报告试验和平板克隆试验检测USP22对HBx生物学功能的影响。结果USP22与HBx存在相互作用。USP22显著增加HBx蛋白稳定性,并通过去除HBx的泛素化抑制HBx通过蛋白酶体降解,进而增强HBx的生物学功能。结论USP22抑制HBx通过泛素依赖-蛋白酶体途径降解,增强HBx蛋白稳定性并促进HBx功能。

晚期糖基化终产物受体慢病毒重组质粒的构建及鉴定

目的构建晚期糖基化终产物受体(RAGE)的慢病毒重组质粒,建立稳定表达RAGE的肝癌细胞模型,以研究RAGE在肝癌发生发展中的致病机制.方法通过PCR扩增RAGE的基因片段,将片段克隆入慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro.随后利用磷酸钙转染法将慢病毒重组质粒与包装质粒共转染HEK293T细胞包装慢病毒,收集慢病毒上清感染肝癌细胞HepG2和Huh7,用嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株.采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测RAGE表达.结果成功扩增了RAGE基因片段,并将其插入慢病毒表达载体中.包装慢病毒感染肝癌细胞后,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示,稳定表达RAGE的肝癌细胞株RAGE的mRNA(P<0.05)和蛋白表达水平明显高于对照细胞.结论采用慢病毒表达载体成功构建了RAGE过表达的肝癌细胞株,为进一步深入研究RAGE的致病机制奠定了良好的基础.