白绒乌鸡MITF基因的cDNA克隆、表达及其对黑色素沉积的影响

【目的】克隆白绒乌鸡小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associaated transcription factor,MITF)基因序列,研究MITF基因在白绒乌鸡各组织中的表达,探索其对白绒乌鸡体内黑色素沉积的影响,为深入研究乌鸡体内黑色素沉积的内在调控机制奠定理论基础。【方法】以150日龄健康的白绒乌鸡为研究对象,采用简并引物和巢式PCR方法从白绒乌鸡皮肤组织中克隆MITF基因c DNA序列,通过DNAStar、Clustal X、Bio Edit和MEGA4.0等软件对获得的序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR法和紫外分光光度法分别研究白绒乌鸡各组织MITF基因的表达特性和黑色素的沉积规律,并应用线性回归方法分析白绒乌鸡各组织MITF基因表达量与黑色素沉积之间的相关性。【结果】经测序和拼接,最终获得了长度为1 431 bp的白绒乌鸡MITF基因的c DNA序列(登录号:KC879241),该序列包含1个完整的CDS区(25—1 431 bp),编码468个氨基酸,预测蛋白分子量为52.42 k D,等电点为6.47;结构域分析发现该基因编码的氨基酸具有1个保守的基础-螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(b HLH-zip)结构。同源比对结果表明,该基因CDS区氨基酸序列与原鸡的同源性高达100%;与其他鸟类同源性达98%以上,与哺乳动物同源性为90%左右;氨基酸系统进化树显示,白绒乌鸡MITF与原鸡的亲缘关系最近,与猪和人的亲缘关系最远。荧光定量PCR结果表明MITF基因表达量在白绒乌鸡各组织间差异达极显著水平(P<0.01),其中以皮肤表达量最高,大约为肾的2.9倍、肌胃的4.4倍、肝的11.4倍、肌肉的86.2倍;紫外分光光度计检测结果显示各组织黑色素的沉积规律与各组织MITF基因的表达规律大体相似,总体趋势表现为皮肤>肾>肌胃>肝>肌肉。相关分析表明,白绒乌鸡组织中MITF基因的表达量与黑色素含量呈显著的正相关关系(P<0.05)。【结论】MITF基因在动物进化中高度保守,该基因表达具有组织特异性,对白绒乌鸡体内黑色素沉积起正向调控作用,其高表达可能有助于乌鸡体内黑色素的形成。