初诊白血病患者溶血磷脂酸酰基转移酶基因表达研究

本研究旨在检测白血病患者溶血磷脂酸酰基转移酶-β(lysophosphatidic acid acyltransferase β,lpaat β)mRNA的表达水平,为lpaatβ靶向治疗在白血病中的应用提供理论基础。采用实时荧光定量PCR方法检测初治白血病患者lpaatβ mRNA的相对表达水平,分析其在各型白血病中的表达情况。结果,急性白血病(AL)患者lpaatβ mRNA的表达高于正常对照组,差异有统计学意义(p<0.05);急性髓系白血病(AML)患者lpaatβ mRNA的表达高于正常对照组,差异有统计学意义(p<0.05),且lpaatβ mRNA的表达水平与外周血白细胞计数(WBC≥20.0×109/L)、白血病细胞CD34表达呈正相关(p<0.05),与患者的髓外侵犯无明显相关性(p>0.05)。除外急性早幼粒细胞白血病(APL)病例之外,lpaatβ mRNA的表达水平与AML患者的化疗敏感性呈负相关(p<0.05)。慢性髓系白血病(CML)患者lpaatβ mRNA的表达高于正常对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。急性淋巴细胞白血病(ALL)患者lpaatβ mRNA的表达与正常对照组相比,差异无统计学意义(p>0.05)。结论:AML、CML患者均存在着lpaatβ基因的超高表达。AML细胞产生的lpaatβ可能在AML细胞的异常增殖及化疗耐药中起着重要作用。

Mangiferin抑制多发性骨髓瘤恶性生物学特性与发挥抗癌效应机制的实验研究

目的:探讨纯中药提取物Mangiferin对多发性骨髓瘤(MM)细胞恶性生物学行为的影响,分析Mangiferin抗骨髓瘤效应的分子机制,为MM替代治疗提供实验依据。方法:不同浓度Mangiferin干预人MM细胞株U266、RPMI8226细胞后,CCK-8法检测细胞增殖,Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡及相关信号通路蛋白的表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测基质金属蛋白酶(MMP)、CXC趋化因子受体(CXCR)家族的表达变化。结果:Mangiferin可抑制U266、RPMI8226细胞增殖活性,并诱导其凋亡。当Mangiferin干预U266和RPMI8226细胞48 h后,U266和RPMI8226细胞中Bcl-2家族促凋亡蛋白Bax表达上调,并下调survivin、Bcl-xL蛋白的表达同时水解活化caspase-3以促进细胞凋亡,且显著下调U266细胞中Bcl-2蛋白表达以诱导细胞凋亡(P<0.05)。在Mangiferin干预MM细胞后,其不仅可增加肿瘤抑制因子p53的表达水平,同时通过抑制抗凋亡分子的表达并下调AKT、NF-κB磷酸化水平继而诱发MM细胞程序性死亡。Mangiferin干预后可明显下调U266细胞CXCR4、MMP2及MMP9的表达(P<0.05),对CXCR2、CXCR7以及MMP13的表达基本无影响(P>0.05);而干预RPMI8226细胞后可下调CXCR4、MMP9、MMP13的表达(P<0.01),对MMP2表达影响微弱,对CXCR2、CXCR7的表达基本无影响(P>0.05)。结论:Mangiferin能抑制MM细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与抑制NF-κB信号通路激活并通过影响Bcl-2家族蛋白表达以及使MMP、CXCR家族核心成员表达受抑等有关。

CXC趋化因子受体1/2在急性白血病中的异常表达及临床意义探析

背景CXCR家族已成为恶性肿瘤领域的研究热点,积极寻找并探究与急性白血病(acute leukemia,AL)发生、发展及预后相关的CXCR家族成员,在抗白血病基础研究与临床诊疗中具有重要意义。目的探索骨髓微环境中CXC趋化因子受体1/2(CXC chemokine receptor 1/2,CXCR1/2)在AL患者骨髓单个核细胞中的表达水平及其与AL患者临床特征、疗效及预后的关系,为寻找AL的治疗靶点和病情监测提供新方向。方法收集2018年11月-2020年12月福建医科大学附属协和医院86例初诊(new-diagnosed,ND)AL患者骨髓标本同时收集26例健康者标本,其中男性17例,女性9例,中位年龄36.5(范围:23~49)岁。采用qRT-PCR技术检测两组人群骨髓单个核细胞中CXCR1/2表达。以CXCR1/2中位表达水平(Expressionmedian)作为界值,将ND-AL患者分为CXCR1/2高表达组和低表达组,分析不同CXCR1/2表达水平与AL患者临床特征及指标之间的关系和临床意义。结果86例ND-AL患者中,包括29例急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)患者和57例急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者。AL组中CXCR1[Md(IQR):0.691(0.176~2.14)vs 0.278(0.088~0.613),P<0.05]、CXCR2相对表达量[Md(IQR):1.938(0.729~3.681)vs 0.419(0.079~1.268),P<0.01]均高于健康对照组,AML组与ALL组的CXCR1/2相对表达量差异无统计学意义(P>0.05);CXCR1/2的高表达与AL不良临床特征和指标有关(P<0.05),易出现髓外浸润、复发难治等不良结局。结论AL患者的CXCR1/2表达上调,其对于AL的病情监测有一定的参考价值。

2-甲氧基雌二醇诱导K562细胞凋亡及机制研究

本研究探讨2-甲氧基雌二醇(2-ME2)对K562细胞的诱导凋亡作用及其机制。采用不同浓度2-ME2处理K562细胞,MTT法检测K562细胞的增殖活性,DNA琼脂糖凝胶电泳和AnnexinV/PI双染色法检测K562细胞的凋亡效应,流式细胞术检测细胞线粒体膜电位的变化,RT-PCR和Westernblot方法分别检测相关基因mRNA和/或蛋白的表达变化。结果表明:2-ME2抑制K562细胞增殖呈时间和剂量依赖性;48小时的半数抑制浓度(IC50)为2μmol/L;2μmol/L2-ME2作用于K562细胞24、48、72小时,DNA凝胶电泳分析可见典型DNA梯形条带;AnnexinV/PI双染色法检测显示,细胞凋亡率分别为13.78%、22.32%和29.43%,而对照组凋亡率仅为1.78%(p<0.05);1、2和4μmol/L2-ME2分别处理K562细胞24小时,流式细胞术检测显示细胞线粒体膜电位下降;2μmol/L2-ME2处理K562细胞24、48和72小时,K562细胞中bcr/abl、bcl-2mRNA表达下调,而baxmRNA表达上调,Bcl-2、procaspase-3、procaspase-9、PARP(116kD)和p-Akt蛋白表达下调,胞浆Cyto-C和PARP活性片段(85kD)表达上调,而对总Akt蛋白表达无影响。结论:2-ME2通过升高bax/bcl-2比值降低线粒体膜电位、促使细胞色素C(Cyto-c)释放入胞浆、触发K562细胞的线粒体凋亡途径,活化caspase-3,导致K562细胞凋亡并抑制其增殖;通过下调bcr/ablmRNA表达以阻断PI3K/Akt信号通路也参与了该过程。

G-CSFR IV型异构体在成年急性髓系白血病的表达及其临床意义

本研究旨在探讨G-CSFR IV型异构体在成年急性白血病患者中的表达及其临床意义。以19例正常骨髓造血干细胞为对照,利用定量RT-PCR检测正常对照、99例成年AML和34例ALL患者的G-CSFR IV/G-CSFR I型异构体的相对表达水平,并对其中84例AML(非M3)患者的临床特征及化疗效果进行分析。结果表明,GCSFR IV/G-CSFR I相对表达水平在AML患者较ALL患者及正常造血干细胞组高,而G-CSFR IV/G-CSFR I的相对表达水平在ALL患者组与正常造血干细胞组差别无统计学意义。AML(非M3)患者的临床特征及疗效分析显示,G-CSFR IV/G-CSFR I相对高表达的患者比低表达的患者的临床CR率低。G-CSFR IV/G-CSFR I相对表达水平与AML(非M3)患者的性别、年龄、幼稚细胞比例、FAB分型、染色体和融合基因所作的危险分层之间无相关性。结论:G-CSFR IV异构体异常高表达与急性髓系白血病预后差相关。

阿德福韦酯预防乙型肝炎携带的非霍奇金淋巴瘤化疗后致乙肝病毒再激活的临床分析

目的探讨阿德福韦酯预防性给药是否减少非霍奇金淋巴瘤化疗中相关性乙肝病毒再激活。方法本科2004～2009年收治的65例携带乙型肝炎病毒的非霍奇金淋巴瘤患者分为预防组30例,对照组35例。预防组在化疗前给予口服阿德福韦酯(10mg/d),至化疗后6个月,对照组患者未接受包括阿德福韦酯在内的核苷酸类似物治疗。比较化疗后乙肝病毒再激活、肝功能损害、化疗延迟等指标变化。结果预防组与对照组相比较在乙肝病毒再激活发生率、肝功能损害发生率、化疗延迟发生率、肝炎相关病死率方面的差异均有统计学意义(P<0.05)。结论预防性口服阿德福韦酯可以降低携带乙肝病毒的非霍奇金淋巴瘤患者乙肝病毒再激活的风险。

退化细胞ZAP-70在慢性淋巴细胞白血病的表达及预后影响

目的:探讨退化细胞、ZAP-70在慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者外周血中的表达及其对预后的影响。方法:利用光学显微镜观察退化细胞在92例CLL患者外周血涂片的检出率;采用流式细胞术检测外周血淋巴细胞XAP-70的阳性率。分析二者之间的相关性,并观察这二项指标与疾病进展的关系。结果:在92例CLL患者中,Binet A期28例(30.5%),Binet B期44例(47.8%),Binet C期20例(21.7%)。外周血涂片退化细胞百分比的中位数为19%(3%～48%)。取≥20%为阳性表达,则退化细胞阳性56例(60.9%);ZAP-70阳性32例(34.8%)。双因素直线相关分析提示二者呈负相关。退化细胞阴性患者临床预后差,较阳性患者的8年无进展生存率(PFS)下降(59.4%vs.86.0%,P<0.05),ZAP-70阳性患者较阴性患者的8年PFS也下降(57.8%vs.79.5%,P<0.05);退化细胞阴性伴ZAP-70阳性患者PFS更低(27.8%,P<0.05)。结论:退化细胞阴性和ZAP-70阳性提示CLL预后不良且二者密切相关。

反应性氮代谢物在白血病中的多重作用

反应性氮代谢物(RNM)是机体代谢过程中,由细胞内存在的一氧化氮合酶(NOS)催化产生的一系列高活性氮中间体,具有比反应性氧代谢物(ROM)更强的氧化与硝化活性,通过多条途径参与多种疾病的发生发展。有证据表明,RNM可能不仅参与白血病的发生发展,在白血病的治疗中也发挥不同效应,本文就RNM在白血病中的作用予以综述。

多毛细胞白血病临床特征与诊治分析

目的分析多毛细胞白血病(HCL)的临床特征、诊疗及预后。方法收集整理2016年1月至2021年2月福建医科大学附属协和医院收治的11例HCL患者的临床资料,分析HCL的临床特征、诊治疗效及预后情况。结果11例HCL患者中男7例、女4例,确诊时中位年龄为57(30~81)岁,从出现临床症状或体征到诊断的中位时间为5.0(0.5~26.0)个月。诊断时伴淋巴瘤B症状(即发热、盗汗、体重减低)者有6例,伴有感染者7例(均为肺部感染),淋巴结肿大3例;所有患者均伴有脾肿大(轻度脾大3例,中度脾大2例,巨脾6例)。11例患者均行一代或二代基因测序检测,B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶V600E突变型(BRAF^(V600E))突变阳性率为81.82%(9/11);外周血常规示两系减少4例(36.36%),三系减少7例(63.64%),单核细胞减少9例(81.82%)。11例患者中,除1例采用FC方案(氟达拉滨50 mg第1~3天;环磷酰胺0.3 g第1~3天)及1例第1个疗程采用R-CVP方案(利妥昔单抗500 mg第1天;环磷酰胺1.1 g第2天;长春地辛4 mg第2天;地塞米松15 mg第1~5天)后改为克拉屈滨以外,其余9例患者均接受克拉屈滨单药治疗。1例采用FC方案治疗的患者1个疗程后即获得完全缓解,余10例中克拉屈滨单疗程治疗者有7例、2个疗程治疗者有3例,4例在克拉屈滨治疗后1~3个月疗效评估为部分缓解,6例4~12个月治疗疗效评估达完全缓解,对克拉屈滨治疗总体反应率为100.00%(10/10)。10例采用克拉屈滨治疗的患者在治疗后出现2~4级血液学不良反应,其中7例(63.64%,7/11)发生绝对中性粒细胞计数减少,6例(54.55%,6/11)患者发生血小板计数减少,4例(36.36%,4/11)发生中性粒细胞缺乏伴发热,3例(27.27%,3/11)发生肺部感染或上呼吸道感染,伴随感染症状患者经抗感染及支持治疗后好转。除血液学不良反应外,无其他不良反应发生。11例HCL患者中位随访时间为14(3~61)个月,中位总生存期与无进展生存期均未达到。随访期间,无患者发生HCL疾病进展、复发或死亡。结论HCL为临床罕见的惰性血液肿瘤,其对克拉屈滨敏感且不良反应可控,对于复发、难治HCL患者可选择进入临床试验或考虑联用其他靶向抑制剂或单克隆抗体。

纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽的制备及其对DIC大鼠的治疗作用

本研究利用酵母表达系统制备纤维连接蛋白(fibronectin,FN)N端肝素结合域多肽,检测多肽的生物学活性,进行多肽治疗DIC大鼠的实验研究。利用PCR技术从FNcDNA中扩增FN N端肝素结合域序列,将获得的目的基因片段克隆至T载体,筛选后转移至酵母表达pAo815SM载体进行选择,再构建重组酵母表达pPIC9K载体,线性化重组载体并转染GS115酵母细胞,在GS115酵母细胞表达目的多肽。发酵液经80%硫酸胺沉淀,沉淀物过S-100柱分离纯化,纯化物再经过SP柱纯化,测定多肽结合肝素等生物学活性。股静脉注射内毒素脂多糖(LPS)50mg/kg建立大鼠DIC模型。建立的DICSD大鼠40只,随机分2组,每组20只,一组为rhFNHN-29多肽治疗组,另一组为生理盐水对照组。治疗组分别于注射LPS前半小时、注射后2小时、4小时尾静脉注射rhFNHN-29多肽(10mg/kg);生理盐水对照组注射等体积生理盐水。另设正常对照组SD大鼠20只,注射等体积生理盐水作为正常对照组。各组大鼠于股静脉注射LPS后6小时,对侧股静脉抽血测血常规,分离血浆检测血浆TNFa和凝血象。于注射LPS后72小时处死大鼠,取肝、肾、脾、肺、心、脑组织进行病理组织学检查。结果表明:成功地在酵母表达系中表达了目的多肽,其表达量达到30mg/L,所表达的多肽具有结合肝素活性。在多肽抗DIC作用的动物实验中发现多肽治疗组的血浆TNFa水平、血常规指标、凝血象和病理组织学的改变都较生理盐水对照组更接近正常对照组。结论:成功地制备了rhFNHN-29多肽,这种多肽能在一定程度上预防和治疗DIC。

三氧化二砷抑制U266细胞增殖、诱导凋亡及与血管内皮生长因子表达的关系

目的探讨三氧化二砷(As2O3)在体外对骨髓瘤细胞系U266增殖、凋亡的影响及与血管内皮生长因子(VEGF)表达的关系。方法四唑盐比色法(MTT)观察As2O3对U266细胞增殖的影响;缺口末端标记法(TUNEL)分析As2O3对U266细胞凋亡的影响;逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测2μmol/LAs2O3不同处理时间后U266细胞VEGF mRNA表达的变化;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测As2O3不同浓度不同处理时间对U266细胞VEGF蛋白表达的变化。结果(1)As2O3明显抑制U266细胞增殖,半数抑制浓度(IC50)为2μmol/L;(2)As2O3能诱导U266细胞凋亡,呈剂量依赖性;(3)As2O3(2,5,10μmol/L)分别处理72h后细胞培养上清中VEGF量呈剂量依赖性减少;(4)考虑细胞增殖对VEGF分泌的影响,2μmol/LAs2O3处理组的上清VEGF量与对照组的差别无统计学意义,RT-PCR显示2μmol/LAs2O3处理的U266细胞个体VEGF mRNA的表达无变化。结论As2O3可以诱导骨髓瘤细胞凋亡,抑制其增殖。As2O3可以通过抑制细胞增殖、诱导凋亡,减少肿瘤负荷,减少VEGF总量,但是不改变细胞个体VEGF的表达。

白血病过继性免疫治疗存在的问题及对策

微小残留白血病（MRL）是造成白血病难治和复发的主要原因。依靠提高剂量及加强化、放疗等手段难以完全清除MRL，且治疗相关的毒副作用大。人们早已认识到白血病的彻底治愈，很大程度上依赖于机体免疫系统对MRL的清除作用，在白血病采用自体或同基因造血干细胞移植（HSCT）时复发率远高于异基因HSCT等事实充分地验证了这一点，其主要原因是后者产生了移植物抗白血病（GVL）效应，从而达到彻底清除白血病细胞的目的。

2-甲氧基雌二醇对白血病细胞周期的影响及其机制

2-甲氧基雌二醇（2-ME2）是17β-雌二醇在体内的生理代谢产物。近来研究发现诱导肿瘤细胞发生周期阻滞是2-ME2发挥其抗肿瘤作用的重要机制。但目前关于2-ME2对白血病细胞周期影响的报道尚少。我们以淋系白血病细胞株CEM和髓系白血病细胞株K562作为研究对象，初步探讨2-ME2对白血病细胞周期的影响及可能的作用机制。

纤维连接蛋白C端肝素结合域多肽在毕赤酵母中的表达、纯化及鉴定

为在毕赤酵母中表达纤维连接蛋白C端肝素结合域(Fibronectin C-terminal heparin-binding domainFNCHBD)多肽并研究其功能,通过PCR技术扩增FNCHBD目的基因,将目的基因与T载体连接,经测序正确后,插入pAo815SM酵母表达载体增加基因拷贝数,然后酶切克隆入酵母表达载pPIC9K;将重组质粒Sal I酶切线性化后转化毕赤酵母菌株,筛选工程菌,经甲醇诱导表达,用SDS-PAGE检测发酵上清液,表明有重组蛋白FNCHBD多肽的高表达,表达产物通过离心、超滤、离子交换层析纯化,纯化产物通过SDS-PAGE、Western blotting印迹、质谱及肝素亲和层沉析对表达产物进行鉴定。结果表明利用酵母工程菌成功表达和纯化了FNCHBD多肽,多肽的分子量接近32 kDa,纯化产物的纯度可达95%以上,能被FN多克隆抗体特异识别且具有多肽肝素结合活性,为后续结构及功能的研究奠定基础。

重组纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽抗内毒素所致小鼠肝衰竭的作用

目的通过动物实验研究重组纤维连接蛋白N端肝素结合域多肽（rhFNHN-29多肽）对内毒素血症肝衰竭的治疗作用。方法用内毒素脂多糖（LPS，Sigma）和半乳糖胺（Galactosamine GaIN，Sigma）注射小鼠腹腔，建立内毒素血症肝衰竭小鼠模型。实验小鼠随机分两组，1组为rhFNHN-29多肽治疗组，1组为生理盐水对照组，另设正常对照组。治疗组分别于注射（LPS和GalN）前半小时，后1、2、3h尾静脉注射rhFNHN-29多肽10mr／kg，生理盐水对照组注射等体积生理盐水，正常对照组注射等体积生理盐水。腹腔注射药物6h，眶静脉采血检测小鼠血浆TNFα，72h后计算小鼠死亡率，处死活鼠，取其肝、肾、脾、肺、心、脑组织进行病理组织学观察，肝组织做电镜超微结构观察，取肝组织对其TNFα、IL-1β、IL-6的表达进行PCR分析。结果生理盐水对照组小鼠72h死亡率为70％，多肽治疗组死亡率仅为15％。病理组织学观察显示生理盐水对照组肝组织呈广泛变性与严重坏死，多肽治疗组肝组织呈小面积变性和轻微坏死。电镜超微结构显示生理盐水对照组肝细胞呈严重的变性和坏死，多肽治疗组轻微变性。肝细胞因子表达分析显示多肽治疗组小鼠的TNFα、IL-1β、IL-6mRNA表达水平及血浆TNFα水平（0．86±0．43，0．86±0．31，0．27±0．13和23．6±5．8，P〈0．01）显著低于生理盐水对照组小鼠的水平（1．26±0．37，0．98±0．21，0．43±0．17和87．43±16．7，P〈0．01）。结论rhFNHN-29多肽对内毒素血症肝衰竭具有明显的预防和治疗作用，其作用机制可能与多肽的抗炎等作用有关。

纤维连接蛋白肝素结合域多肽在昆虫表达系中表达及活性鉴定

目的:将纤维连接蛋白N端和C端两个肝素结合域基因片断克隆至昆虫表达系统中进行表达,分离纯化所表达多肽并进行多肽结合肝素、FN抗原性和抗血小板减少内毒素血症活性鉴定。方法:用高保真PCR技术从FNcDNA中扩增目的基因片段,将目的基因片段克隆至昆虫表达系的Bac-to-Bac HT Vector,在E.coliDH5α中抗氨苄青霉素选择,挑选阳性菌斑通过PCR、酶切鉴定和DNA序列测定,确定无误,再扩增提取质粒,进一步转染MAX Efficiency DHIOBac^(TM)Competent E.coli,经三种抗菌素(卡那、庆大、四环素)联合IPTG、X-gal蓝白斑选择,挑取阳性白色菌斑提取质粒,PCR、酶切鉴定和DNA序列测定,确定无误,转染Sf 9昆虫细胞获取重组杆状病毒,重组杆状病毒再次转染Sf9昆虫细胞表达多肽。裂解Sf9昆虫细胞,SDS-PAGE分析裂解上清,镍离子亲和树脂分离纯化表达的多肽,Western blot鉴定多肽结合肝素和FN抗原性活性。动物实验探讨rhFNHC-36多肽抗血小板减少内毒素血症的作用。结果:纤维连接蛋白N端和C端两个肝素结合域多肽均在昆虫表达系统中得到表达,所表达的多肽具有与肝素结合的能力而不具FN抗原性。动物实验初步显示rhFNHC-36多肽具有抗血小板减少内毒素血症的作用。结论:在昆虫表达系统中表达纤维连接蛋白N端和C端两个肝素结合域多肽是可行的,所表达多肽具生物活性,但表达量尚较低,有待进一步优化表达以提高表达量。