Fe^(3+)(NTA)还原菌的固定化小球制备及还原特性

采用海藻酸钠包埋驯化得到的优势铁还原菌,用于还原络合吸收法脱除NOx过程中形成的中间副产物Fe3+(NTA)。结果表明,最佳包埋条件为海藻酸钠质量浓度4%,菌体质量浓度0.2%,CaC l2质量浓度3%,此条件下制备的小球还原性能好,在微生物用量为20 g(湿重)/L时还原10 mmol/L Fe3+(NTA),经12 h反应后还原率达到96.1%,而相同条件下游离微生物的还原率仅为11.8%,但反应16 h后游离微生物与固定化小球的还原率相近,均为97%左右。但此法制备的小球机械强度不高,溶胀、破裂现象严重。通过添加聚乙烯醇和硅藻土改良固定化小球,可强化小球的机械强度、降低小球的溶胀及破裂现象,对Fe3+(NTA)的还原效果也较改良前的小球有所提高,两者最佳添加量均为20 g/L。改良后的小球与游离微生物相比,耐酸性增强,在pH=5的条件下,仍具有79.8%的还原效率,远高于相同条件下游离微生物的39.5%,但对温度的适应范围两者基本一致。

起始密码子下游区域AT含量优化工具BestAT的开发与应用

基因的表达水平受到起始密码子下游区域AT含量的影响,从巨大的序列集中筛选出具有特定AT含量和密码子用法特征的同义序列是一个繁琐的工作。本文研发AT含量优化工具"BestAT",初步解决了自动获取海量同义序列和充分展示同义序列的密码子用法特性两个关键问题,并且实现了与密码子用法数据库(CUD)的无缝结合,采用了密码子参数的原位标示和AT含量曲线等直观方式展示序列特性,为这类实验设计提供有力的支持。

Codon Usage Database自动寻错平台CUDer的组建与应用

密码子用法数据库(CUD)是密码子用法与密码子优化研究领域的一个重要的在线服务,为了找出该数据库中潜在的两种不再适用的记录,即已过期的陈旧记录和在遗传密码类型上实际无法有效支持的记录(简称不支持记录),本文通过结合前期自主研发的两个软件BestCodon与CUDassist,组建了CUD自动寻错平台CUDer,并应用于上述问题的研究。结果发现,CUD中存在317条陈旧记录与4条不支持记录。对于陈旧记录,这些记录的物种分类号在NCBI中已发生变更,研究者应该避免使用这些记录的相关数据;对于不支持记录,本文借助CUDer计算得到这些记录正确的密码子用法表(CUT),弥补了当前CUD的不足。此外,该平台也为面向CUD的自动化数据处理,提供了一个新的软件框架,具有一定的借鉴意义。

多环芳烃定量结构-生物降解性关系

通过Chem3D软件及查阅文献得到17种典型多环芳烃的17种理化参数(~1X^V、~1X^V、~2X^V、~3X^V、S、V_c、H_f、logP、MR、G、S_w、M_wμ、E_(homo)、E_(lumo)、E_c、E),以生物比降解速率常数的对数形式(lgk_b)为观测量,运用SPSS 13.0统计软件分析生物降解性与分子结构的关系,回归分析得两种QSBR模型:logK_b=-0.326~1X+0.05μ+0.228E_(lumo)-0.094(线性模型);logK_b=-0.053 (~1X^V)~3-0.755(~1X^V)~2+2.807~1X^V-3.909(非线性模型)。从QSBR模型可见,多环芳烃生物降解主要受空间结构参数的影响,而疏水性常数、分子极性、电性参数等影响较小。

表面活性剂CTAC和STAB对四尾栅藻的毒性效应

采用室内培养法考察了十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)和十八烷基三甲基溴化铵(STAB)对四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)的生长状况、蛋白质含量、叶绿素含量、脂质过氧化丙二醛(MDA)含量以及超氧化歧化酶(SOD)活性的影响,分析了CTAC和STAB对四尾栅藻的毒性机理。结果表明:CTAC和STAB对四尾栅藻的生长抑制效应受浓度和时间的影响显著,STAB对四尾栅藻的毒性大于CTAC,且CTAC和STAB作用4d内,藻种蛋白质、叶绿素含量以及SOD酶活性均先上升后下降,MDA含量下降。根据5种指标变化与CTAC(或STAB)之间呈现的浓度-效应关系和时间-效应关系推测,表面活性剂对藻细胞的最初攻击点是通过改变其细胞膜膜脂分子的水溶性,破坏四尾栅藻的细胞膜;表面活性剂通过刺激细胞产生活性氧自由基引起脂质及其他生物大分子的氧化损伤可能是其对四尾栅藻产生毒害效应的主要机制。

来自桔青霉的阿魏酸酯酶的分离纯化、理化性质

【目的】从桔青霉的发酵液中分离纯化了胞外阿魏酸酯酶(PcFAE)并进行了酶学性质的研究,初步探讨了PcFAE对麦糟的酶解作用。【方法】利用(NH4)2SO4沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Phenyl Sepharose6Fast Flow疏水层析纯化得到电泳纯的阿魏酸酯酶。【结果】从该菌株的发酵液中获得一阿魏酸酯酶,该酶亚基分子量约为31kDa,全酶分子量约为58kDa。其最适pH为6.0,最适温度为45℃-65℃,在pH5.0-6.0及25℃-55℃之间,酶保持了较好的稳定性。Mg2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+和Na+对酶活有一定的促进作用,Zn2+对PcFAE酶活有一定的抑制作用,而Cu2+、亮抑肽素、抑肽酶有显著的抑制作用,Hg2+、苯甲基磺酰氟几乎完全抑制了酶活。EDTA对PcFAE活性无明显影响。PcFAE的kcat/Km对香豆酸甲酯、芥子酸甲酯、阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯的值分别为823、416、103、0,PcFAE对MpCA的催化效率最高。PcFAE作用于麦糟,当5U PcFAE/g麦糟时,其阿魏酸的释放量为7.2%。【结论】获得了一阿魏酸酯酶,其理化性质与至今报道的阿魏酸酯酶有所不同,为阿魏酸酯酶的开发提供了重要的实验依据。

开发可统计任意密码子用法的软件BestCodon

密码子偏好是自然现象,分析密码子的用法可以优化表达基因,即密码子优化,从而调节目的基因在特定宿主中的表达水平。现有密码子用法分析软件多数只限于单个密码子,适用于密码子对和密码子三联体的较少见。本文提出1种可统计任意密码子用法的软件结构,开发出1个密码子用法统计软件"BestCodon",拥有序列检查和密码子用法统计2个模块。检查模块可代替人工校对,剔除输入序列中非规范字符,为后续分析提供正确的、符合规范的数据。统计模块根据用户指定的密码子组合类型,结果返回特定的密码子用法表。本文还探讨序列检查和密码子用法统计中计算机的运算特性,结果表明该软件检查1条长达150000 bp的序列仅耗时约0.2 s,而从中统计密码子十联体的用法仅耗时约0.1 s。

密码子用法数据库辅助工具CUDassist的开发

密码子用法的研究是遗传密码的进化、基因的水平转移、基因表达的调控和异源表达的优化等领域不可或缺的内容。2个重要的密码子用法在线服务密码子用法数据库(CUD)和图形化密码子用法分析器(GCUA)为研究者提供了有力的数据支持,但仍存在一些问题,如密码子用法数据库可接受的检索方式过于单一,在特定密码子用法表(CUT)中Fraction参数值显示有误,图形化密码子用法分析器仅提供2个密码子用法表的比对视图等。本文针对这些问题,研发了密码子用法数据库辅助工具"CUDassist",做出4个改进:(1)增加密码子用法数据库的可检索方式;(2)修正密码子用法数据库中Fraction值显示错误的问题;(3)在密码子用法表中直接给出相对适应度(RA)参数值;(4)提供多个密码子用法表的比对视图。从而为研究者提供更方便、准确和丰富的密码子用法的信息,并在一定程度上有效融合了密码子用法数据库和图形化密码子用法分析器的功能,实现一站式服务。

高通量高频密码子软件HighCodon的开发

特殊密码子的鉴别是密码子用法研究中的重要课题,对基因工程领域中密码子优化的实验设计起到关键性作用。高频密码子提供了其中1种方法,但其界定标准仍存有问题。本文研发的高通量高频密码子软件HighCodon,解决了在海量序列数据中检验该标准的适用性问题的瓶颈,为相关研究提供有力的工具支持。该软件主要包括3个功能模块,即输入解析模块、密码子用法表生成模块和高频密码子鉴别模块,并具备3个显著特点:(1)多数据源性,可接受3种类型的输入,即本地FASTA格式的序列文件、本地密码子用法表(CUT)格式的CUT文件和远程密码子用法数据库(CUD)的CUT地址,兼顾本地和远程两种数据来源;(2)高灵活性,支持3种输入的混合形式;(3)高通量性,多条输入记录的批量处理。该软件与重要在线服务CUD具有良好的整合,可方便获取高达35799个物种的CUT,同时进行高频密码子分析。此外,为了便于CUT数据存储和交换,本文参照FASTA格式,提出1种CUT格式。

蛋白质虚拟定点突变和饱和突变软件的开发

定点突变和饱和突变是研究蛋白质结构与功能关系、获取新酶的重要手段。如何在计算机上快速、准确地获取突变序列是实施高通量虚拟筛选的首要问题。本文提出一种可满足虚拟突变需求的软件架构,开发出一个蛋白质虚拟突变软件"PMu",拥有序列检查、定点突变和饱和突变3个模块。序列检查模块可代替人工校对,剔除输入序列中潜在的非法字符,为后续分析提供正确的、符合规范的数据。定点突变模块根据用户指定的位点和目标残基,启动对输入序列的自动突变功能,此突变包括替换、删除、插入3种形式。饱和突变模块通过分化参数设置,灵活实现标准饱和突变、自定义饱和突变和亚饱和突变等处理。该软件为相关研究快捷地提供准确的突变序列,可进一步用于同源建模、能量分析、分子动力学模拟以及实际的突变实验等。本文还探讨突变处理中计算机的运算特性,并指出该类型软件今后的2个发展方向。

基于对应分析的密码子用法可视化研究

密码子用法可以简介为物种、基因组、基因或序列集中64种密码子的使用方式。密码子用法的可视化为研究样本的密码子用法特征、不同样本间的密码子偏好,提供了1种直观、有效的图形化手段。可基于多种参数的对应分析(CA)法是其中1种重要的可视化方法。在本文中,以果蝇、人类、拟南芥、酿酒酵母、线虫、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及除虫链霉菌8个物种的密码子用法数据为例,通过比较密码子实际出现次数(Number)、密码子用法频率(F1000)、密码子用法分值(Fraction)、相对适应度(RA)与相对同义密码子用法(RSCU)5种参数的可视化结果,得到如下初步结论:(1)不论采用5种参数中的哪1种,65维(一维物种+64维密码子)的数据都可通过CA降维为7维,而此时的累计惯量为100%,即完全还原原数据集中的所有信息;(2)采用密码子平均用法(F1000)是1个较好的选择,其前二维的累计惯量可以达到83.6%,但是基于Fraction可以获得更高的累计惯量,达到85.1%,Number、RSCU次之,在考虑计算量的情况下,选择Number也可以获得失真度较小的结果,RA参数的最低,仅有76.9%。

甘油脱氢酶基因在大肠杆菌中的密码子优化表达

【目的】利用密码子优化技术,提高甘油脱氢酶基因gldA在大肠杆菌中的表达水平。【方法】针对gldA起始密码子下游区域,优先选择AT含量最高的同义密码子,从而在不改变氨基酸序列的前提下,提高该区域的AT含量。利用大引物PCR的方法对野生型gldA-WT进行定点突变,获得优化型基因gldA-4,与pET-32a(+)连接后,构建表达质粒pET-gldA-4,转入E.coli BL21(DE3),得到工程菌E.coli-4。同时,设定包含gldA-WT的工程菌E.coli-WT作为对照,摇瓶发酵后,以甘油为底物检测比较表达产物的酶活力。【结果】gldA-4相对gldA-WT而言,改变了第2、5、6位密码子中的4个碱基,AT含量从53.3%提高到80.0%。相应地,E.coli-4的粗酶液的酶活力为191.3 U/mL,比E.coli-WT的48.3 U/mL提高了3倍多。【结论】本优化方案简便、快捷,但可明显提高甘油脱氢酶的酶活力,有望成为改善目的基因异源表达水平的一种通用方法。

2种方法对不同pH下猪胰岛素结构的分子动力学模拟

为了研究猪胰岛素单体在不同pH下的动态变化,本文从已有的NMR实验数据出发,通过2种不同的方法对胰岛素单体进行了MD模拟,方法1在已知不同pH下晶体结构及氨基酸侧链质子化状态时进行模拟,方法2为从特定晶体结构出发,通过设定部分氨基酸侧链的质子化状态来模拟不同pH下蛋白的结构变化。方法2在某些文章中已被使用,但是没有人探索过该方法是否具有普适性。本文的研究表明,方法2可以比较好地模拟不同pH下蛋白的结构变化,该方法可能具有普适性。针对胰岛素B链C末端的PheB24和PheB25的结构变化,PheB25的侧链在pH为6左右时会移动到胰岛素表面,同时PheB24处的β折叠会转变为无规卷曲,这一结果表明该处的β折叠可能并不是胰岛素单体聚合为二聚体的必要条件。