水产品主要过敏原的模拟胃液消化实验的条件优化

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blot)方法,通过体外模拟消化实验分析水产品主要过敏原原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)和小清蛋白(Parvalbumin,PV)的消化特性,主要研究酶/蛋白的比值、pH值对模拟胃液(SGF)消化过敏蛋白稳定性的影响。结果表明,提高胃蛋白酶的相对量使甲壳类水产品TM从消化稳定性转变成消化不稳定性,但是TM具有较强的消化稳定性,当酶/蛋白比值提高到10/1时,一些稳定的降解条带仍未被完全分解;当pH≥5时胃液消化会受到抑制,甲壳类水产品TM和鱼类PV均不会被消化分解。在优化条件(0.33U酶/μg蛋白,pH3.5)的SGF消化试验中,甲壳类水产品TM具有较高的消化稳定性,而鱼类PV能被较快分解;甲壳类水产品过敏蛋白相对于非过敏蛋白具有较高的消化稳定性,其降解产物仍可能引起过敏反应的发生。

鳜鱼(Siniperca chuatsi)幽门垂中两种胰蛋白酶的cDNA克隆及其生物信息学分析

采用RT-PCR、3′-RACE及5′-RACE技术从鳜鱼幽门垂组织中克隆了两种胰蛋白酶(分别命名为TRS-A与TRS-B)cDNA全长序列。将测序结果递交GenBank数据库,分别获得登录号为ACD70339和ACD70340。采用生物信息学的方法和工具预测了鳜鱼胰蛋白酶的理化参数及其高级结构,并构建了系统进化树。结果表明:(1)TRS-A和TRS-B的cDNA开放阅读框编码的蛋白序列中均含有一段长度为15个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸残基组成的激活肽、222个氨基酸残基组成的成熟蛋白区域;(2)TRS-A成熟蛋白的相对分子量为24.1kDa、理论等电点为5.69,TRS-B的相对分子量为24.2kDa、理论等电点为5.75;(3)建立了TRS-A和TRS-B的三维结构模型,预测了其活性位点及12个半胱氨酸残基形成二硫键的位置。

乌鳢(Channa argus)胃蛋白酶原基因克隆及其生物信息学分析

采用RT-PCR和3′RACE技术,首次从乌鳢胃组织中克隆了一种胃蛋白酶原基因。测序结果表明,该基因开放阅读框全长1086bp编码361个氨基酸,递交GeneBank数据库,获得登录号为GQ303143。系统进化关系分析表明,该乌鳢胃蛋白酶原氨基酸序列与鳜鱼类的胃蛋白酶原A2亲缘关系最近,从而推测本研究克隆的乌鳢胃蛋白酶原属于胃蛋白酶原A2类。采用生物信息学的方法和工具预测了该乌鳢胃蛋白酶原的理化参数及其高级结构,结果表明,该乌鳢胃蛋白酶原的相对分子量为38.8kDa,理论等电点为4.56。采用同源建模法建立了乌鳢胃蛋白酶原的三维结构模型,预测了其活性位点及6个必需半胱氨酸残基的位置。该研究结果为进一步研究乌鳢胃蛋白酶的结构和功能关系奠定了基础。

鱼类肌肉中过敏蛋白的检测与分析

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）方法，分别对淡水鱼（鲤鱼、鲢鱼、鲫鱼）和海水鱼（黄鳍鲷、金鲳）等5种鱼肌肉，鳕鱼丸、鲢鱼丸两种鱼糜制品以及鲮鱼、沙丁鱼、鳗鱼3种鱼罐头中过敏原（小清蛋白）的含量进行了分析．结果显示，应用抗蛙小清蛋白单克隆抗体（PARV-19）可以分别在5种鱼白色肉和红色肉的肌浆蛋白中检测到特异性杂交条带，其分子量大小约为12-14．4ku，且白色肉中的含量明显高于红色肉．但在5种鱼的肌原纤维蛋白、2种鱼糜制品和3种鱼罐头中，均未检测到小清蛋白．因此得到结论，无论是淡水鱼还是海水鱼，小清蛋白主要存在于白色肉肌浆蛋白中；经过加工的鱼制品中小清蛋白的含量有很大程度的降低．

猪肌肉葡萄糖6-磷酸异构酶的分离纯化及性质研究

葡萄糖6-磷酸异构酶(Glucose-6-phosphate isom erase,GPI;EC5.3.1.9)能催化果糖6-磷酸(fructose-6-phosphate,F-6-P)异构为葡萄糖6-磷酸(glucose-6-phosphate,G-6-P),是糖原酵解过程中的重要酶之一。本研究通过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose、SP-Sepharose以及Hydroxyapatite层析等方法从猪肌肉中分离纯化得到GPI,纯化倍数为105.6,比活力为159.4U/mg。SDS-PAGE和凝胶过滤层析表明猪GPI为单体蛋白,分子量约为55kDa。免疫印迹检测结果显示,猪GPI能够和抗白姑鱼GPI多克隆抗体发生免疫交叉反应。酶学性质显示猪GPI的最适温度为50℃,最适pH为8.5。在pH8.5、25℃条件下测得其Km值为0.39mmol/L,最大反应速率Vmax为0.61mmol/L·min。

蟹类主要过敏原的模拟肠胃液消化及其对过敏原活性的影响

目的:通过模拟肠胃液消化试验,分析锯缘青蟹肌肉中过敏原(原肌球蛋白)的消化特性以及消化对过敏蛋白致敏性的影响。方法:采用美国药典提供的模拟胃、肠液配方,测定青蟹原肌球蛋白和肌原纤维蛋白在体外模拟肠胃环境中的消化稳定性。以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Western-blot)进行分析。结果:在模拟胃液反应中,非过敏原蛋白尤其是肌球蛋白重链和肌动蛋白等被胃蛋白酶快速降解,而原肌球蛋白在60min时仍未被完全分解。在模拟肠液反应中,相对于致敏蛋白,肌球蛋白重链、肌动蛋白等非过敏蛋白在较短的时间内被分解,原肌球蛋白尽管120min后几乎被完全分解,但会产生一些较稳定的蛋白降解片段。以免疫印迹法检测过敏患者血清,结果分子质量为34kDa的原肌球蛋白降解产物仍具有过敏原性。结论:蟹类过敏蛋白相对于非过敏蛋白具有较高的消化稳定性,而且其高分子质量降解产物仍可能引起过敏反应。