中国医学分子微生物学的现状与展望

21世纪是以分子生物学为代表的生命科学的世纪,它将推动生物学由细胞水平向分子水平、基因水平发展。在分子微生物学基础研究方面,目前已搞清大肠杆菌基因约40%,已查明噬菌体的全部基因顺序,大约60%的基因亦已搞清。对某些细菌和病毒的复制、基因克隆、核苷酸序列,编码基因、增强子、启动子的结构与功能进行了深入的研究。在病原微生物检测技术方面,已由过去第一代的微生物常规分离培养技术,第二代的生化等快速诊断技术,第三代的单克隆抗体技术进入目前正在兴起的第四代基因诊断(基因探针和PCR)技术。前三代诊断技术都是以疾病的表型改变为依据。

DnaJ类分子伴侣PBP基因的原核表达及兔抗PBP抗体的制备

目的:在原核系统中表达DnaJ类分子伴侣感光受体外周蛋白结合蛋白(PBP)基因,并制备兔抗PBP的抗体鉴定其特性。方法:应用RTPCR从人胎脑组织总RNA中扩增PBPcDNA。测序后将其克隆到表达载体pET28a中,并在大肠杆菌中以IPTG诱导表达。表达产物经NiNTA亲和层析柱纯化后,用SDSPAGE进行鉴定。以所获纯化的PBP免疫新西兰白兔,制备兔抗PBP抗体。抗体的效价及特异性用Westernblot进行测定和分析。结果:扩增和克隆出了720bp的PBP基因。构建的重组质粒pET28aPBP在大肠杆菌中得到高表达,诱导表达的蛋白存在于包涵体和细菌裂解上清中,纯化的PBP经SDSPAGE鉴定呈单一条带。以纯化的PBP免疫兔,制备了兔抗PBP抗体。Westernblot鉴定证实,该抗体可与原核表达的PBP特异性结合,抗体效价为1∶1600。结论:在原核细胞中表达了具有生物学活性的PBP,并以其为免疫原制备了兔抗PBP的抗体,为进一步研究PBP的结构与生物学活性奠定了基础。

DnaJ类分子伴侣PBP的基因克隆及亚细胞定位研究

目的:从人骨骼肌cDNA文库中,分离、鉴定视网膜感光受体外周蛋白的结合蛋白(PBP)-DnaJ(HSP40)类分子伴侣,并初步分析其在转染的哺乳动物细胞中的表达及分布。方法:以33p-dCTP标记探针杂交筛选人骨骼肌cDNA文库,对阳性克隆进行序列分析,并以脂质体介导转染哺乳动物细胞,用免疫印迹及间接免疫荧光染色法检测目的蛋白的表达。结果:筛选出全长pbp基因,经与GenBank中的序列比较分析证实,与DnaJ家族的1个成员-mrj(1.5 kb)的序列相同,且含140 bp左右富含GC的非编码区上游序列。在COS-7细胞 中瞬时表达的PBP,大多呈典型的胞浆分布,而J-domain缺失的pbp片段多为胞核分布。而在CHO细胞中稳定表达的PBP,在处于不同细胞周期时相的细胞中的分布不同。结论:DnaJ除与HSP70(DnaK)协同发挥重要功能外,其本身作为分子伴侣也可能发挥着重要作用,且与细胞周期可能存在某种密切联系。

抗PAI抑制作用的组织纤溶酶原激活剂在大肠杆菌中的表达

目的: 构建t-PA活性不被PAI-1抑制的新一代t-PA突变体.方法: 根据t-PA的结构特点,去除t-PA分子中的指状区、表皮生长因子和Kringle1区,以含全长t-PA编码区序列的pUC18质粒为模板,经PCR扩增编码氨基酸1～3和176～527位的截短式t-PA DNA序列; 并将该t-PA分子中的PAI-1结合位点,即第373～384位核苷酸(AAG CAC AGG AGG)突变为(GCG GCC GCG GCG),相应的氨基酸KHRR则变为AAAA.结果:测序证实,t-PA突变体的DNA序列正确,将其克隆于大肠杆菌表达载体中,并在大肠杆菌中得到高效表达.表达蛋白占总菌体蛋白的30%,以包涵体形式存在.经蛋白质变性、复性,得到有活性的t-PA突变体.t-PA突变体与PAI-1反应后t-PA的活性未受到抑制.结论:t-PA突变体可能是一种用于治疗心肌梗死和脑血栓等血栓性疾病的强效且剂量要求低的新型生物工程药物.

白细胞介素-18基因肌肉注射产生明显抗肿瘤作用(英文)

为了探讨人白细胞介素 (h IL ) - 1 8基因转导的抗肿瘤作用 ,构建了 h IL- 1 8c DNA真核表达质粒载体 pc DNA3/h IL- 1 8.将 pc DNA3/h IL- 1 8经脂质体包裹 ,按照 1 0 0μg/只的剂量注射入雄性Balb/c小鼠后肢肌肉 ,在设定时间处死小鼠取注射部位肉提取总 RNA,应用半定量反转录聚合酶链反应 (RT- PCR)及免疫组化法检测了 h IL- 1 8m RNA及其蛋白质在小鼠肌肉中不同时间点的表达水平 .随后 30只雄性 Balb/c小鼠于基因注射后第 7d腹部皮下 (i.d.)或腹腔内 (i.p.)接种 1×1 0 5个同系小鼠 S- 1 80肉瘤细胞 .观察了 S- 1 80肿瘤细胞在腹腔及皮下的生长情况、小鼠体重、肿瘤重量及存活时间 .结果发现 ,pc DNA3/h IL- 1 8注射后 2 d能检测到 h IL- 1 8m RNA表达 ,第 7d表达量较高 ,第 2 8d仍有 h IL- 1 8m RNA表达 .免疫组化染色显示了注射部位散在有 h IL- 1 8蛋白质颗粒 .h IL- 1 8基因注射组小鼠体重、肿瘤重量均比对照组轻 (P值分别小于 0 .0 0 5、0 .0 5) ,存活时间比对照组延长 .结果显示 ,真核表达系统 pc DNA3/h IL - 1 8经脂质体包裹肌注后能有效表达 ,具有明显的抑制肿瘤生长作用 .

新型人肿瘤坏死因子基因在血管内皮细胞中的靶向表达

目的探索一条肿瘤特异性基因治疗的新途径。方法将新型人 TNF- α D11a基因和 KDR特异性启动子插入到 3’L TR缺失 2 99bp的逆转录病毒载体 p L XSN中 ,构建成 p L XSN- D2 99- KDRp- TNF- α D11a重组逆转录病毒载体 ,使目的基因转录受 KDR启动子驱动。通过脂质体介导将该重组载体转染 PA317包装细胞 ,并用病毒上清感染血管内皮细胞和NIH3T3细胞。分别经 EL ISA和 MTT法测定 TNF- α D11a在血管内皮细胞中的表达及其生物学活性。结果成功构建了携带 TNF- α D11a和 KDR启动子的逆转录病毒载体 ,TNF- α D11a在血管内皮细胞中的表达水平及细胞增殖抑制作用均高于NIH3T3细胞。结论 KDR启动子可使外源 TNF-

应用PCR－ECL技术检测食品中的沙门氏菌

应用ＰＣＲ－ＥＣＬ技术检测食品中的沙门氏菌卢强，陈贵连，林万明沙门氏菌在食品公共卫生上有重要的意义，需要对其进行快速、敏感、特异的检测。由于聚合酶链反应（ＰＣＲ）有很高的特异性和敏感性，并且能在较短时间内对大量标本同时进行检测，所以是一种较理想的检测...

HRP直接标记属特异性基因探针检测沙门氏菌的研究

以活化辣根过氧化物酶复合物（ＨＲＰ—ＰＢＱ—ＰＥＩ＋—ＮＨ３＋）直接标记沙门氏菌属特异性ＤＮＡ探针ｐＬＳ２和ｐＬＳ３，探针与靶ＤＮＡ杂交后催化发光底物，经增强型化学发光反应（ＥＣＬ），用普通Ｘ光胶片自显影（ＣＰＤ）检测沙门氏菌。经狭缝杂交（Ｓｌｏｔｂｌｏｔ），该法标记探针均可检测到０．１ｐｇ的纯质粒ＤＮＡ及１０３个未经培养的鼠伤寒沙门氏菌。Ｄｏｔ—ｂｌｏｔ杂交结果证明，ＨＲＰ标记的探针仅与沙门氏菌属细菌杂交，而与试验的其他肠道非沙门氏菌不杂交。本研究表明，ＨＲＰ直接标记基因探针化学发光自显影法检测沙门氏菌，安全、快速、简便，且有高度的敏感性和特异性，是一种有较大应用前景的非放射性标记探针杂交检测方法。

感光受体外周蛋白结合蛋白对虫荧光素酶体外折叠的促进作用

探讨感光受体外周蛋白结合蛋白 (PBP)在体外是否有促进变性蛋白质复性的作用。虫荧光素酶用盐酸胍变性 ,然后在PBP、HSP70、HSP6 0存在下进行体外复性 ,用虫荧光素酶分析系统检测该酶的复性程度。结果显示PBP对虫荧光素酶的复性能力很低 ,当与HSP70同时作用时 ,酶活力明显高于PBP或HSP70组 ,而PBP与HSP6 0组合对酶的复性能力较HSP6 0组未见有明显差异 ;当PBP ,HSP70 ,HSP6 0三者同时存在时 ,酶活力恢复率最高。去除复性缓冲液中的ATP及其再生系统 ,酶活力的复性率明显下降。结果表明PBP具有协助HSP70 。

+Gz反复暴露对大鼠主动脉和心脏组织中HO-1、p21及LCAD表达的影响

目的:观察+GZ反复暴露对大鼠心脏及主动脉组织HO-1、p21和LCAD基因表达的影响。方法:提取+GZ反复暴露后1h组及对照组大鼠心脏、主动脉组织总RNA,经半定量RT-PCR检测其mRNA水平。结果:+GZ反复暴露后心脏组织HO-1、p21和LCAD mRNA水平明显升高,主动脉组织中LCAD mRNA水平上调。结论:在+GZ反复暴露状态下,HO-1是心脏组织中一个早期重要的抗过氧化损伤,维持正常功能的保护性因子。

正加速度重复暴露大鼠脑差异表达基因的筛选

目的 筛选大鼠经正加速度 (Gositiveacceleration ,+Gz)重复暴露后脑的差异表达基因 ,探讨 +Gz重复暴露致脑损伤的分子机制。方法 应用抑制性消减杂交技术 ,构建高消减效率的 +Gz重复暴露大鼠脑cDNA消减文库 ;用差异筛选技术筛选阳性克隆 ;用序列分析确定阳性克隆的性质 ;用RT -PCR证实阳性克隆的可靠性。结果 从消减库中获得70个阳性克隆 ;经差异筛选后 ,选取其中 10个阳性克隆 ,序列分析表明 ,7个克隆与已知基因高度同源 ,3个为新的候选基因。RT -PCR证实了差异表达基因在 +Gz重复暴露大鼠脑中高表达。结论 用抑制性消减杂交技术筛选发现的 3个新的cDNA可能在

脂蛋白脂酶基因多态性与飞行员血脂水平的关系

目的了解脂蛋白脂酶(LPL)基因多态性与飞行员血脂水平的关系,为飞行员高脂血症的防治提供依据。方法采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性方法检测106例飞行员和98例健康对照者LPL基因HindⅢ、PvuⅡ和Ser447Ter位点多态性,并用常规方法测定其血脂水平。结果飞行员LPL基因HindⅢ、PvuⅡ和Ser447Ter位点多态性的基因型频率和等位基因频率与健康对照人群相比差异无统计学意义。飞行员的高脂血症患病率(52.83%)明显高于对照人群(29.59%)。LPL基因HindⅢ和Ser447Ter位点的不同基因型与飞行员血清TG和HDL-C水平相关,而PvuⅡ位点不同基因型与血清TG、TC和HDL-C水平相关。结论 LPL基因多态性影响飞行员不同个体间血脂水平,环境因素是引起飞行员高脂血症的重要作用因子。

强直性脊柱炎患者肿瘤坏死因子α启动子308位点基因多态性分析

目的:探讨肿瘤坏死因子(TNF)α启动子308位点基因多态性与强直性脊柱炎(AS)的相关性。方法:用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对112例AS患者和96例健康对照人群,以及98例HLA B27阳性AS患者和14例阴性AS患者的TNF-α启动子308位点基因多态性进行分析。结果:AS患者GG、GA和AA三种基因型频率分别为60.71%、36.61%和2.68%,G和A的等位基因频率分别为0.790和0.210,对照组三种基因型频率分别为81.25%、17.71%和1.04%,等位基因频率分别为0.901和0.099,两组基因型和等位基因频率分布有显著性差异(P<0.01),AS患者的A等位基因频率明显高于对照组。HLA-B27阳性AS患者和阴性AS患者的基因型频率亦有显著性差异(P<0.01)。结论:TNF-α启动子308位点基因多态性与AS相关,A等位基因可能增加AS的易感性。

高+Gz反复暴露后大鼠心脏组织应激性差异表达基因的分离(英文)

目的筛选+Gz反复暴露后大鼠心脏组织特异性应激基因。方法采用动物离心机处理对照组和实验组大鼠,实验组G值为+10 Gz,增长率为1 G/s,峰值持续3 min,共做3次,两次间歇30 min,对照组动物在离心机经历类似实验步骤,所承受的G值为+1 Gz;反复暴露后1 h提取实验组和对照组大鼠心脏组织总RNA,分离纯化poly A+RNA,与Atlas Rat Stress Array膜杂交,并用半定量RT-PCR进行差异基因表达的特异性鉴定。结果得到10个差异表达基因,其中8个在+Gz反复暴露后大鼠心脏组织中表达上调,2个表达下调,选取热休克蛋白70、P21和血红素加氧酶-1基因作为候选基因,经半定量RT-PCR得到特异性验证,P21和血红素加氧酶-1表达水平升高,热休克蛋白70表达下降。结论应用Atlas Rat Stress Array杂交技术可以发现与+Gz反复暴露相关的特异性应激基因,为+Gz反复暴露对心脏组织的作用机制研究提供新的思路和方法。

飞行员低密度脂蛋白受体基因NcoⅠ位点多态性对血脂的影响

目的了解飞行员低密度脂蛋白受体(LDL-R)基因NcoⅠ位点多态性及与血脂的关系,为飞行员高脂血症的防治提供依据。方法采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性方法,检测106例飞行员和98例健康对照者LDL-R基因NcoⅠ位点的多态性,并用常规方法测定其血脂水平。结果飞行员LDL-R基因NcoⅠ位点3种基因型-/-、-/+和+/+的频率分别为13.21%、48.11%和38.68%,-和+2种等位基因频率分别为0.373和0.627,与健康对照人群比较差异无显著性。飞行员的高脂血症发生率(52.83%)明显高于对照人群(29.59%,P<0.01)。飞行员-/-、-/+和+/+3种基因型的TC分别为(4.17±0.55)mmol/L、(4.59±0.61)mmol/L和(4.82±0.84)mmol/L,LDL-C分别为(2.18±0.48)mmol/L、(2.48±0.69)mmol/L和(2.74±0.75)mmol/L,其水平与基因型的关系为-/-、-/+向+/+递增,而TG和HDL-C在各基因型间无差异,与健康对照组相似。结论LDL-R基因NcoⅠ位点多态性是影响飞行员个体间血脂水平差异的独立遗传因素,但环境因素的作用也很重要。

飞行员线粒体DNA调控区基因多态性分析

目的探讨线粒体DNA调控区基因多态性与飞行员飞行耐力的关系。方法利用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)分析86例飞行员和80例普通人群线粒体调控区基因多态性。结果飞行员线粒体DNA调控区RFLP分布与普通人群有统计学差异。结论线粒体DNA调控区基因多态性可能在飞行员的飞行耐力中起重要作用。

α_(2A)-肾上腺素能受体基因调控区单核苷酸多态性对基因转录活性的影响

[目的]探讨α_(2A)-肾上腺素能受体基因-1296位单核苷酸多态性对受体基因转录活性的影响。[方法]以基因组 DNA为模板,扩增α_(2A)-肾上腺素能受体基因 5’侧翼序列(2 085 bp),-1296位分别为g或c,与报告基因载体pGL3-enhancer相连接,构建重组载体,分别与pRL-CMV共转染人绒癌细胞JEG-3,检测荧光素酶相对表达量。[结果]成功构建重组质粒 pGL3FSg/pGL3FSc,荧光素酶检测结果显示,当5侧翼-1296位为g时,荧光素酶基因表达量高,而为c时,荧光素酶基因表达量低。[结论]a_(2A)-肾上腺素能受体基因5’侧翼-1296位为g时,基因转录活性较高;为c时,基因转录活性较低。

飞行员线粒体DNA高变区Ⅰ单核苷酸多态性研究

目的了解飞行员线粒体DNA高变区Ⅰ单核苷酸多态性(SNP)分布特点,探讨耐力相关的基因标记。方法以86例飞行员和80例健康对照人群为研究对象,用PCR产物直接测序的方法检测线粒体高变区ⅠSNPs,并与剑桥序列比对,确定SNPs的位点、类型及频率。结果飞行员和健康对照人群线粒体DNA高变区ⅠSNPs分布频率高于10%的位点分别有11个和8个,高于20%的位点分别有7个和5个,其中飞行员C16257A和C16261T位点频率明显高于健康对照组。结论线粒体DNA高变区ⅠSNPs位点C16257A和C16261T有可能与飞行员飞行耐力相关。

飞行员血管紧张素转换酶、血管紧张素原和血管紧张素受体1基因多态性分析

目的:了解飞行员血管紧张素转换酶(ACE)基因插入/缺失(I/D)多态性、血管紧张素原(AGT)基因M235T多态性和血管紧张素受体1(ATR1)基因A1166C多态性情况,探讨三种基因多态性与飞行员耐力可能的关系。方法:用聚合酶链反应(PCR)扩增和产物酶切技术检测253例飞行员和236例健康对照者的三种基因多态性。结果:飞行员组ACE II基因型(45.06%)和I等位基因频率(0.67)显著高于健康对照组(分别为31.36%和0.52),而AGT和ATR1基因多态性在两组间无明显差异。结论:ACE I基因有可能在飞行员的飞行耐力中起重要作用。