人PSP94与TNFα衍生物联合治疗人前列腺癌的实验研究

构建了表达人 PSP94、TNFα衍生物 ( TNFα D1 1 a)及 PSP94与 TNFα D1 1 a( PSP94- TNFαD1 1 a)双功能蛋白真核表达质粒 pc DNA- TNFα D1 1 a、pc DNA- PSP94和 pc DNA- PSP94- TNFαD1 1 a,与 rh PSP94和 rh TNFα D1 1 a蛋白分别在人前列腺癌裸鼠移植瘤动物模型上进行了 PSP94与 TNFαD1 1 a联合治疗人前列腺癌的实验研究 .当动物肿瘤直径长至约 1 0 mm时 ,将以上 3种真核表达质粒分别以 50 μg/只的量给相应组动物的左右四头肌内注射一次 ,同时设 pc DNA3.0空载体对照组 ;rh PSP9450μg/kg、rh TNFαD1 1 a 1 0 0万单位 /kg、rh PSP94和 rh TNFαD1 1 a以同样剂量联合给药 ,肌肉注射 ,每 d一次 ,连续 1 0 d,同时设环磷酰胺阳性对照组和生理盐水阴性对照组 .基因治疗动物给药后第 1 5d处死 ,蛋白治疗组停药后第 2 d处死 ,观察疗效 ,计算抑瘤率 .结果显示 ,以上述方式给药 ,无论是基因治疗组还是重组蛋白组 ,给 PSP94的动物肿瘤虽然未见明显缩小 ,但肿瘤组织均出现不同程度的坏死和液化现象 ;给 TNFαD1 1 a的未见明显的抑瘤效果 ;PSP94-TNFαD1 1 a融合基因或 rh PSP94+ rh TNFαD1 1 a联合给药 ,不仅肿瘤有所缩小 ,而且也有不同程度的坏死和液化现象出现 .初步认为 :( 1 )

PCR快速检测临床标本中肺支原体的应用研究

肺炎支原体（ＭＰ）是引起呼吸道严重感染和造成地方性流行的常见传染病。该菌临床培养时间长，易受污染。我们用自行合成的引物，建立了ＰＣＲ直接检测临床标本中ＭＰ的方法，通过标本前处理，６８例病人标本ＰＣＲ直接检测的阳性率可达到３８．２％，并可在半天内报告结果，为人类原发性非典型肺炎的临床快速诊断提供了简便快速和特异敏感的检测手段，具有重要的临床应用价值。

人血小板生成素全长分子在酵母系统中的分泌表达及活性分析

外源基因可通过整合型载体被整合到毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）染色体上，获得遗传性稳定分泌表达株．利用酵母信号肽ＭＦα，对该信号肽蛋白酶识别位点的相关序列进行重新设计，使天然人ＴＰＯ成熟肽在毕赤酵母系统中分泌表达成功．表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ进行分析，分子量约为６６ｋＤ处蛋白条带可被ＴＰＯ抗体识别；表达量约为０．１ｇ／Ｌ；Ｎ端氨基酸序列分析结果与设计的一致；表达产物对小鼠骨髓细胞形成巨核细胞集落形成单位（ｍｅｇａｋａｒｙ－ｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ，ＣＦＵ－Ｍｅｇ）具有明显的刺激作用．

SAPGTP和PG为接头的5'IL6-TNFα衍生物融合蛋白

通过计算机模拟比较十种理论上柔性较好的接头在 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白中对 Ｉ Ｌ６ 和 Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构的影响情况，从中选择了 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ接头．以 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ 作为接头的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ和以 Ｐ Ｇ 为接头的５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构预测结果相似． Ｄ Ｎ Ａ 序列分析两种蛋白的接头序列均与设计的一致．５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ和 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ蛋白的大肠杆菌表达产物经初步分离、纯化及鉴定后，生物学活性及对高表达 Ｉ Ｌ６ 受体肿瘤细胞的杀伤作用比较结果显示：在 Ｌ９２９细胞上，前者的生物学活性是后者的 ２７ 倍；在 Ｕ９３７ 细胞上，前者对肿瘤细胞的抑制率是后者的１３ 倍．它们对高表达 Ｉ Ｌ６ 受体的 Ｕ９３７ 细胞杀伤作用分别是同样突变位点的人 Ｔ Ｎ Ｆα衍生物的３７ 和 ２９ 倍．实验表明， Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ作为接头构建的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白优于以 Ｐ Ｇ 作为接头构建的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白．

脆弱拟杆菌DNA探针在临床上的应用

目的在 ＤＮＡ水平上准确鉴定 Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（脆弱拟杆菌）。方法用脆弱拟杆菌种特异的探针 ｐＢＦ－１５与分离株或标本进行ＤＮＡ点杂交。结果８株生化鉴定为脆弱拟杆菌的７株经ＤＮＡ探针证实为脆弱拟杆菌；１株粪拟杆菌、１株吉氏拟杆菌和２株未能鉴定到种的拟杆菌经探针重新鉴定为脆弱拟杆菌。用 ｐＢＦ－１５直接检测了 ４６例临床标本，其结果与常规法符合。结论 ＤＮＡ探针鉴定脆弱拟杆菌或诊断脆弱拟杆菌感染比常规法准确、快速、简便。

幽门螺杆菌PCR检测的研究进展

幽门螺杆菌是急性、慢性胃炎、和十二指肠溃疡的致病菌，并可能与胃癌有关，因此对该菌进行检测在临床上具有重要价值，本文仅就ＰＣＲ应用于该菌检测的标本处理，引物设计，扩增步骤、扩增产物的分析和ＰＣＲ诊断的临床意义等做简要介绍。

酵母系统表达TPO与E.coli表达TPO N端结构域生物半衰期比较

为了探讨血小板生成素（ＴＰＯ）糖基化与其生物半衰期的关系，首先纯化了巴氏毕赤酵母系统分泌表达的人ＴＰＯ成熟肽和大肠杆菌表达的人ＴＰＯＮ端结构域蛋白．纯化产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定和活性分析后，两种蛋白以相同浓度或相同活性单位给Ｗｉｓｔｅｒ大鼠尾静脉注射，利用酶联免疫分析（ＥＬＩＳＡ）和ＴＦ１细胞测定不同时间点实验动物血浆中ＴＰＯ浓度或生物学活性，求出两种ＴＰＯ的生物半衰期（ｔ１／２）值．结果显示，以相同浓度和相同活性单位给药，ＴＰＯ成熟肽的ｔ１／２均比其Ｎ端结构域的长，前者分别是后者的１．６５倍和１．２７倍．

人PSP94全长cDNA的获得及PSP94-TNF~Δ融合蛋白的构建

利用ＲＴ－ＰＣＲ从人肥大前列腺组织钓取９４个氨基酸的人前列腺分泌蛋白（ＰＳＰ９４）全长ｃＤＮＡ，序列分析结果与文献报道的完全一致．将ＰＳＰ９４成熟肽与人ＴＮＦα衍生物（ＴＮＦΔ）通过Ｌｉｎｋｅｒ－ＳＡＰＧＴＰ在基因水平上融合成５′ＰＳＰ９４－ＴＮＦΔ，融合基因ＤＮＡ序列分析结果与设计的相符合．５′ＰＳＰ９４－ＴＮＦΔ在大肠杆菌中表达产物分子量约为３１ｋＤ，表达量约占菌体总蛋白量的３５％．以Ｌ９２９细胞和人前列腺癌细胞株ＰＣ－３为靶细胞进行细胞毒分析结果表明，５′ＰＳＰ９４－ＴＮＦΔ融合蛋白既具有ＴＮＦ的细胞毒活性。

人PSP94的分泌表达及其表达产物抗前列腺癌作用

将编码人 94个氨基酸的前列腺分泌蛋白 ( PSP94) c DNA与酵母整合载体 p PICZαA重组 ,构建的重组质粒线性化后转染酵母细胞 GS1 1 5,获得了 PSP94在酵母细胞中遗传性稳定表达酵母工程细胞 .诱导后的培养物中 ,rh PSP94表达量约为 0 .9mg/L,分子量约 1 6.5k D.培养上清经离子交换层析纯化后 ,目的蛋白的纯度为 92 % .体外在人前列腺癌细胞上活性分析表明 ,rh PSP94以1 0 0μg/L ,对该细胞的抑制率 2 0 .4% ;单纯新型 TNF,以 1 0 3 U/ml,抑制率 2 9.8% ;rh PSP94和新型 TNF以上述同样剂量联合应用 ,抑制率为 86.3% .提示 PSP94在体外对抗前列腺癌细胞有杀伤作用 ,但不明显 ;PSP94与新型 TNF联合应用 ,可使抑制率明显提高 ,可能 PSP94与新型 TNF有协同抗前列腺癌的作用 .

从胃活检组织中分离幽门螺杆菌

比较了不同培养条件和方法对胃活检组织中幽门螺杆菌检出率的影响，从而建立了一种有效的分离培养方法。临床２０例胃活检组织，１４例组织学检查阳性，１０例快速尿素酶和常规尿素酶试验阳性，８例细菌培养阳性，显示此培养方法敏感性５７．１％（８／１４）。

NF-κB与TNF的抗肿瘤作用

TNF具有较强的抗肿瘤作用 ,但某些高表达TNFR的肿瘤细胞对其仍有抗性。核转录因子κB(NF κB)与肿瘤细胞抵抗凋亡有关 ,TNF与肿瘤表面的TNFR结合后可激活NF κB ,反过来NF κB又可抑制TNF对肿瘤细胞的细胞毒作用。众多的研究提示 ,抑制NF κB能够增强TNF抗肿瘤作用。本文对这方面的有关研究作一综述。

人TPON端结构域在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

在利用反转录－ＰＣＲ从人胎肝中获得编码人血小板生成素（ｈＴＰＯ）全长ｃＤ－ＮＡ的基础上，综合ＴＰＯ结构与功能的研究信息，在大肠杆菌中表达了成熟肽Ｎ端结构域．目的蛋白在菌体内以包涵体形式存在，表达量约占菌体总蛋白的３０％；包涵体经变性、复性、凝胶过滤、离子交换层析等步骤处理后，所得产物给Ｂａｂｌ／ｃ小鼠腹腔连续注射８ｄ，第９ｄ摘眼球采血，计数血小板的数量．结果表明，ＴＰＯＮ端结构域具有明显促进血小板生成的作用．

微量免疫荧光试验和PCR在诊断肺炎衣原体急性感染中的应用

目的 探讨肺炎衣原体 (Cpn)急性感染在呼吸道疾病中的重要性。方法 用微量免疫荧光 (MIF)试验检测了 93例住院病人血清中Cpn抗体IgG ,同时用PCR测定了其中 5 5例病人咽试子标本中CpnDNA。结果 3 5 .5 %呼吸道疾病存在Cpn急性感染。在肺炎组抗体 (效价≥ 5 12 )阳性率为 47.6% ,提示 1998～ 1999年可能处在北京市Cpn流行期 ;在哮喘组的阳性率达到 5 0 % ;在肺心病组和肺癌组的阳性率分别为 5 0 .0 %和 2 6.3 %。PCR检测Cpn的阳性率仅为 9.1% ,MIF和PCR的检测结果存在差别。结论 检测Cpn抗体IgG有助于对Cpn急性感染进行诊断 。

PSP57不是增生和癌变前列腺组织PSP94 mRNA可变剪切特有的产物

目的 :比较人正常、增生和癌变前列腺组织中PSP94和PSP5 7mRNA的表达情况。方法 :提取事故死亡的正常成年人前列腺组织及手术得到的增生和前列腺癌组织总RNA ,进行RT PCR ,其产物分别以PSP94和PSP5 7共有的外显子及PSP94外显子Ⅲ作探针进行Southernblotting分析 ;RT PCR产物经克隆后进行序列测定。结果 :三种前列腺组织中均有PSP94和PSP5 7mRNA的表达 ;人正常前列腺组织中的PSP94及PSP5 7的基因序列与增生前列腺组织和癌变前列腺组织中的完全一致。结论 :PSP5

新型人TNFα对小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤作用

本文研究了一种重组人ＴＮＦα衍生物（ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ）对小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌的抗肿瘤作用。同时与原型重组人ＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）的抗肿瘤作用进行了比较，并对它们全身给药和局部给药的抗瘤效果作了对比。Ｃ５７ＢＬ／６小鼠接种肿瘤细胞后ｄ７，将ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ和ｒｈＴＮＦα以高、中、低三种剂量分别连续肌肉注射４ｄ，或瘤内注射３ｄ，停药后１ｄ处死动物，根据抑瘤率进行疗效评价。结果表明，ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ各剂量组的抑瘤率均显著高于同样剂量的ｒｈＴＮＦα；两种ＴＮＦ瘤内注射的抗肿瘤作用均明显优于肌肉注射。

外源血小板生成素基因体内导入对循环免疫因子水平的影响

目的：研究外源ＴＰＯ基因由质粒载体导入后，小鼠体内一些细胞因子的变化规律。方法：用脂质体将表达人ＴＰＯ的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｈＴＰＯ包裹后，注射到Ｂａｌｂ／ｃ鼠的后肢肌肉内，用ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血液中多种细胞因子的水平。结果：在ＴＰＯｃＤＮＡ转移到体内后，血液中ＩＦＮγ、ＴＮＦα和ＩＬ２迅速升高。其中，ＩＦＮγ与血小板计数呈明显负相关，并且在血小板计数回落后，保持在对照水平的９～１２倍；ＴＮＦα仅在第１周内与之成正相关，但可达对照水平的１２０倍；ＩＬ２升高幅度较小，与ＴＰＯ水平相一致。血液中Ⅱ型组织相容性抗原分子也呈升高趋势，与ＩＬ２的变化类似；而Ⅰ型分子与ＴＮＦα的变化相似。结论：ＴＰＯ在多方面刺激了机体免疫机能，而免疫因子如ＩＦＮγ在血小板生成过程中起重要的调节作用。

血小板生成素转导鼠T淋巴细胞的增殖和分化

为探讨ＴＰＯ（血小板生成素）基因导入对Ｔ细胞增殖和分化影响的规律，将编码人ＴＰＯ的质粒ＤＮＡ６０μｇ用脂质体包裹后，经肌肉途径转导入Ｂａｌｂ／ｃ小鼠体内。用ＣＤ４和ＣＤ８的特异性抗体标记小鼠各种免疫组织中的Ｔ细胞，借助流式细胞术分析它们的组成和变化。结果发现ＴＰＯ基因导入使骨髓中的成熟和未成熟Ｔ细胞数量在经过短期下降后全部大幅度增多，胸腺未成熟Ｔ细胞增加；而脾脏和血液循环中成熟Ｔ细胞增多，特别是在血液中ＣＤ４阳性细胞的增加最为明显。这些特点大约在基因导入后两周内形成，并持续至少两周以上。本文所得的结果提示ＴＰＯ是一种免疫促进分子，ＴＰＯ基因导入后小鼠血液中多种淋巴因子的升高与它过量表达对Ｔ细胞的刺激有关。

人TPON端结构域在毕赤酵母中的分泌表达及产物鉴定

目的在酵母系统中分泌表达人ＴＰＯＮ－端结构域，对其生物学活性进行初步研究，为与其它ＴＰＯ分子进行ＴＰＯ糖基化生物学意义的研究打基础。方法将编码人ＴＰＯ成熟肽Ｎ端１９５个氨基酸的ｃＤＮＡ与酵母整合型载体ｐＰＩＣＺαＡ重组，构建的重组质粒用ＤｒａⅠ消化成线性ＤＮＡ，转染酵母细胞ＧＳ１１５，使ＴＰＯ基因整合到酵母染色体上；用ＴＰＯ抗体筛选获得遗传性分泌稳定表达的重组酵母细胞株；用ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定ＴＰＯ产物及分子量；用对小鼠骨髓细胞形成巨核细胞集落形成单位（Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ，ＣＦＵ－Ｍｅｇ）的方法测定活性。结果获得了ＴＰＯＮ－端结构域在酵母系统中的分泌表达，表达产物可被ＴＰＯ抗血清识别，分子量约为２２０００；其产物对小鼠骨髓细胞形成ＣＦＵ－Ｍｅｇ具有明显的刺激作用。

PSP94-TNFα D11a融合基因直接注射的抗肿瘤作用

目的 探讨人PSP94和肿瘤坏死因子α衍生物 11a(TNFαD11a)融合基因 (PSP94 TNFαD11a)直接注射的抗肿瘤作用。 方法 人前列腺癌裸鼠模型肌肉注射含PSP94 TNFαD11a融合基因的pcDNA PSP94 TNFαD11a质粒DNA ,剂量为 5 0 μg/只 ,同时设 pcDNA PSP94、pcDNA3 .0空载体、生理盐水和环磷酰胺对照组。注射后第 2 0d处死动物 ,称瘤重计算抑瘤率。 结果 pcD NA PSP94 TNFαD11a组抑瘤率为 2 3% ,为 pcDNA PSP94组的 1.4倍。以同样方式给药 ,pcDNA PSP94 TNFαD11a质粒DNA对小鼠Lewis肺癌的抑制率为 31% ,为pcDNA TNFαD11a组的 2 .1倍。结论 pcDNA PSP94 TNFαD11a质粒DNA的直接注射具有抗肿瘤作用。