组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞

目的培养符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。方法用组织块法行原代培养，胰蛋白酶消化法行传代培养，免 疫组织化学染色进行细胞鉴定。结果６ｄ时，细胞开始由组织块边缘向外生长；１５ｄ时，即可进行传代。角蛋白染色示细 胞纯度达９５％以上。结论组织块法培养人绒毛膜滋养层细胞简便易行，可获得符合实验要求的人绒毛膜滋养层细胞。

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的构建人骨形态发生蛋白7(humanbonemorphogeneticprotein7,hBMP-7)逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcell,MSCs)mRNA的表达。方法构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67,制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞,采用原位杂交、RT-PCR检测hBMP-7mRNA在MSCs中的表达。结果成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体,经hBMP-7基因转染的MSCs可表达外源性BMP-7mRNA。结论采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至MSCs中并表达外源性基因。

三氧化二砷诱导人类恶性淋巴瘤细胞凋亡及机制探讨(英文)

目的研究三氧化二砷(As2O3)在体外对人类伯基特氏淋巴瘤细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法分别采用来源于人类伯基特氏淋巴瘤的EB病毒阳性细胞Raji和EB病毒阴性细胞BJAB为模型,利用细胞形态学检测、DNA凝胶电泳和蛋白质Western blotting分析等方法,从细胞形态、DNA水平和蛋白质水平探讨As2O3诱导恶性淋巴瘤凋亡及作用机制。结果分别采用2, 5和10 mol/L的As2O3与Raji和BJAB细胞作用24 h后,DNA凝胶电泳证实As2O3通过诱导细胞凋亡而抑制细胞的增殖。BJAB和Raji细胞对应于上述浓度As2O3的凋亡率分别47.6%±4.8% (Mean±SD, n=3), 66.4%±5.1% , 87.0%±7.3% 和35.5%±3.8%, 51.5%±6.2%, 62.2%±7.9,BJAB细胞对As2O3的敏感性要高于Raji细胞(P<0.05)。Western blotting蛋白质检测表明,As2O3通过下调抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达和激活凋亡分子caspase-3诱导细胞凋亡。结论As2O3通过下调Bcl-xL蛋白的表达和激活caspase-3诱导人类恶性淋巴瘤细胞的凋亡;本研究可望为临床应用砷剂治疗恶性淋巴瘤提供实验依据。

SD大鼠乳鼠胰岛细胞体外培养方法探讨

目的探讨一种获得足量、纯度高和功能良好的大鼠胰岛细胞的体外培养方法.方法采用胶原酶对胰腺组织进行分次短时间消化;细胞接种18 h时,倒置显微镜下观察细胞生长情况;将细胞转入新的培养板培养,定期收集培养液上清.分别检测胰岛素、淀粉酶含量及葡萄糖刺激下的胰岛素分泌水平.结果SD大鼠乳鼠原代培养的胰岛细胞中成纤维细胞明显减少,双硫腙可染率85%～90%,锥虫兰染色细胞活力90%以上,培养7～11d的细胞分泌功能正常.结论用胶原酶反复短时间消化胰腺组织,细胞接种后及时转板的方法可获得纯度较高、生长良好、适合实验研究的胰岛单层细胞.

转染人骨形态发生蛋白在兔骨髓间充质干细胞中的表达

目的采用基因转移技术将人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因转染兔骨髓间充质干细胞(BMSc),检测外源基因的表达。方法常规分子生物学技术构建hBMP-7逆转录病毒载体,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,感染兔骨髓间充质干细胞,使用原位杂交以及免疫组织化学的方法检测hBMP-7在BMSc中的表达。结果原位杂交和免疫组化检测经hBMP-7基因转染的BMSc中出现阳性结果,未转染的BMSc中未见阳性结果出现。结论采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至BMSc中,并有外源性基因的表达。

dsRNA阻断大鼠骨髓源性神经干细胞Hes5表达的实验研究

目的 观察外源性短双链RNA(dsRNA)在转录后水平即mRNA水平降低基因表达的效率，并对其影响因素进行初步探讨。方法 将体外分离培养的大鼠骨髓基质细胞，通过由本实验室配制的特殊培养基诱导成神经干细胞，应用人工合成的dsRNA于不同浓度转染神经干细胞，Western bloting检测dsRNA是否能阻断转录因子Hes5的表达，0．5％锥虫蓝法测定各浓度组中培养细胞活力。结果 200、300nmol／L浓度的dsRNA能特异有效地阻断Hes5的表达，而50～200nmol／L浓度的dsRNA有利于干细胞存活。结论 dsRNA能在神经干细胞内启动RNA干扰作用，适宜浓度的dsRNA能在特异有效地阻断内源性基因的表达的同时，最大限度地保持细胞活力。

人绒毛膜滋养层细胞的培养

取妊娠 ６～１０周的人妊娠早期绒毛膜，用胰酶／ＤＮＡ酶消化，换瓶纯化处理，经光镜和电镜检测证实，我们建立了稳定的人绒毛膜滋养层细胞培养体系。

过氧化氢抑制三氧化二砷诱导的伯基特氏淋巴瘤细胞凋亡

目的探讨过氧化氢(H2O2)对三氧化二砷(As2O3)诱导人类伯基特氏淋巴瘤细胞凋亡的影响及双染法荧光显微技术在检测细胞凋亡中的作用。方法应用As2O3诱导人类伯基特氏淋巴瘤细胞株BJAB细胞凋亡,采用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)核染料双染法荧光显微镜和透射电镜对细胞死亡进行观察及定量分析。结果BJAB细胞经As2O3处理后,荧光显微镜下可见大多数细胞出现细胞染色质凝集、核边集、核碎裂等凋亡的特征性改变;在低剂量(200 μmol/L)H2O2的影响下,抑制了As2O3诱导的细胞凋亡,降低细胞的死亡率;细胞的死亡方式由凋亡转变为核固缩性坏死,表现为既无凋亡的特征性改变,又非典型的细胞坏死,死亡细胞的细胞核呈固缩状态而非肿胀。结论低浓度(200 μmol/L)H2O2可抑制临床治疗浓度的As2O3诱导的人类伯基特氏淋巴瘤BJAB细胞凋亡;双染法荧光显微镜技术不但可明确区分细胞凋亡及坏死,还可判断早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞,并可进行定量分析,是一种良好的细胞凋亡检测方法。

小鼠成纤维细胞中PLC水解肌醇磷脂的数学模型

目的 :构建小鼠成纤维细胞中磷脂酶C水解肌醇磷脂的数学模型 .方法 :以细胞实际信号传递过程为基础、以准稳态近似为原则 ,利用微分方程建立数学模型模拟肌醇磷脂的代谢过程 .结果 :建立了一磷酸肌醇和表皮生长因子受体间浓度关系的微分方程 ,并以此来描述肌醇磷脂的水解速度 .结论 :本数学模型描述了肌醇磷脂代谢的生物学特征以及主要产物间的浓度依赖关系 ,讨论了各个参数对肌醇磷脂代谢的数学模型的影响 ,分析了磷酸肌醇

降落式PCR和SSCP检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体γ基因重排

目的以降落式PCR和单链构型多态性(SSCP)方法检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体(TCR)γ基因重排,探讨其在淋巴细胞白血病诊断中的价值。方法盐析法提取淋巴细胞白血病患者外周血白细胞DNA,TCR-γ基因重排通用引物和降落式PCR扩增基因重排。分别采用琼脂糖凝胶电泳、SSCP和DNA直接测序方法检测PCR扩增产物。阳性细胞系DNA模板与反应增生性淋巴组织DNA按不同比例混合后扩增,检测降落式PCR的灵敏度。结果琼脂糖电泳中,18例T淋巴细胞白血病中有15例、4例B淋巴细胞白血病中有2例为阳性,阳性标本经SSCP进一步分析,呈不连续条带。DNA直接测序证实扩增产物为TCR-γ基因重排。阳性对照模板占1%以上时可得到阳性扩增结果。结论TCR-γ基因重排通用引物结合降落式PCR可有效扩增T淋巴细胞白血病基因重排,可用于T淋巴细胞白血病的辅助诊断。

EGFR反义RNA的转染对人类鼻咽癌CNE-2细胞EGFR的表达下调及恶性表型的抑制(英文)

目的利用反义RNA 抑制靶基因表达的策略,下调EGFR的表达而探讨对人类低分化鼻咽癌CNE-2细胞的恶性表型的抑制性效应。方法将人EGFR的N-端1.35kb片段反向构建入逆转录病毒表达载体pLXSN中,并用脂质体介导转染人鼻咽癌CNE-2细胞,G418筛选并分离阳性克隆,将两个EGFR 反义cDNA转染的克隆细胞命名为CNE-2/AS4 和CNE-2/AS8,而空载体转染的细胞命名为CNE-2/pLXSN。125I-EGF配体结合分析细胞膜上EGFR的表达,台盼蓝染色法测定细胞生长的改变,并用软琼脂集落形成实验检测细胞转化,最后,将筛选的各组阳性克隆细胞分别注射入裸鼠皮下,不同时间观察肿瘤生长的抑制改变及肿瘤的转移状况。结果配体结合实验结果显示,两个选择的克隆CNE-2/AS4 和CNE-2/AS8细胞表面EGFR的数量分别较未转染细胞CNE-2下降18%、45%,表明EGFR反义RNA的表达下调了细胞膜上EGFR的表达;同时,EGFR反义RNA表达的CNE-2细胞生长速率和软琼脂生长能力也较对照组细胞明显降低。注射入裸鼠皮下后,EGFR反义RNA表达的阳性克隆细胞表现出肿瘤生长减慢,淋巴结和肺转移能力也明显降低。结论这些实验结果提示EGFR 反义cDNA转染的CNE-2细胞能下调EGFR的过量表达并部分抑制鼻咽癌的恶性表型,这为进一步阐明EGFR在鼻咽癌的发生。

PLCγ1在胰腺腺泡细胞分布的电镜免疫细胞化学研究

采用电镜免疫细胞化学的方法研究PLCγ1在小鼠胰腺腺泡细胞中的表达状况。发现其主要表达在腺泡细胞的酶原颗粒及粗面内质网内,其次线粒体、高尔基复合体及核内也有一定程度的表达。结果表明PLCγ1与胰腺分泌功能紧密相关,还可能参与了蛋白质合成、细胞能量代谢、DNA合成、细胞有丝分裂及增殖过程。

磷脂酶C—γ1和γ2在PDGF促成纤维细胞克隆形成中的不同作用

目的 探讨磷酯酶Cγ1和γ2（PLC－γ1和γ2）在血小板源性生长因子（PDGF）诱导小鼠成纤维细胞克隆形成信号传导中的作用。方法 将全长PLCγ2cDNA亚克隆进真核细胞表达载体，转染小鼠成纤维细胞株PLC－γ1－／－和PLC－γ1^+/+，使PLC－γ2在成纤维细胞中表达，同时以未插入目的基因的空载体转染这两种细胞作为实验对照。用有限稀释法随机挑选几个单细胞克隆，经Western Blotting鉴定其PLC－γ2表达量，转染细胞及其相应对照被用来测量克隆形成能力。结果 PLC－γ2可在PDGF的作用下活化，对克隆形成有显著的正调控作用，而PLC－γ1基因对克隆形成无任何影响。并且γ2利于细胞低密度时的存活，因而，PLC－γ2可显著促进低密度细胞的克隆形成,γ1可能有相反作用。结论 PLC－γ1和γ2在PDGF诱导小鼠成纤维细胞克隆形成中的有不同作用。

磷脂酶C-γ1和γ2对成纤维细胞生长及增殖的影响

目的 观察磷脂酶C-γ1和γ2基因在血小板源性生长因子(PDGF)诱导的成纤维细胞生长和增殖信号转导中的作用。方法 测定PDGF刺激后，敲除磷脂酶C-γ1基因的细胞株及其转染磷脂酶C-γ2基因后的生长和增殖能力，并对数据进行统计学分析。结果 磷脂酶C-γ1和γ2在PDGF引起的细胞生长、增殖信号转导中均有正调控作用，并不是必需的因素，两者有协同作用，但各自的作用力度和时期不同，γ1作用显著，γ2作用较弱且较晚；磷脂酶C-γ1对DNA合成和细胞周期进程有重要影响，缺失时，细胞G1和S期缩短，DNA合成能力增强；γ2对DNA合成无显著影响，但在野生型成纤维细胞中表达时，可使S期提前并相对延长。结论 在成纤维细胞中，磷脂酶C-γ1和γ2对细胞生长和增殖的影响各不相同，有相同处，起不同程度的协同作用；又有不同处，不能相互取代。

NO含量和NOS活性在兔软骨终板退变过程中的变化

目的研究一氧化氮(NO)和一氧化氮合成酶( NOS)在软骨终板退变中的作用。方法将24只新西兰白兔分为实验组(n=12)和对照组(n=12),实验组通过切除兔腰椎棘上、棘间韧带,咬除部分关节突关节,分离椎旁肌造成腰椎软骨终板退变模型,分别于术后12、24、36周对腰椎摄X线片,并检测不同时间段的软骨终板中NO含量和NOS活性。结果X线片示软骨终板随时间的延长而逐渐钙化,且实验组较对照组钙化明显;实验组各组的NO含量及NOS活性较对照组增多(P<0.05),而24周与36周实验组间NO含量及NOS活性差异不明显(P>0.05)。结论NO和NOS在软骨终板退变过程中,其含量相应增加,提示NO可能在软骨终板退变的形成和发展中起重要作用。

广东人AGTR2突变热区的SNPs位点分析

【目的】 研究广东汉族人群中血管紧张素Ⅱ 2型受体基因(AGTR2)是否存在特有的SNPs位点?【方法】 收集121例祖籍广东的汉族人?取外周静脉血以酚/氯仿法分离白细胞提取基因组DNA,根据AGTR2基因已知的SNPs的位点分布特点设计两对引物,PCR扩增目的片段?对PCR产物进行SSCP分析,银染显色?根据染色结果,随机抽取部分带型不同的PCR产物直接测序,对测序结果通过BlASTn软件和ClustalW软件在线分析?【结果】 发现5个SNPs位点:G300663A,A300672T,A300818T,G301404T和A301410G,除A301410G与Gen-Bank dbSNP数据库中的位点(rs5194)相同外,其余4个位点为新发现的SNPs位点?【结论】 AGTR2是一个高突变的基因,广东人AGTR2的SNPs位点多,与其他人群显著不同?

冷冻保存对人类附睾精子功能的影响

目的：了解人类附睾精子经历冷冻保存后的精子功能变化。方法：应用精子功能检测方法。结果：１１ 例先天性双侧输精管缺如患者附睾精子标本冷冻保存后，每例冷冻标本均见活动精子，但精子活动率显著降低，精子活动能力减弱。精子膜完整率显著下降，头膜损伤－ 尾膜完整的精子率（ Ⅲ型精子） 显著升高，精子体外存活时间显著缩短。精子顶体蛋白酶活性降低。去透明带地鼠卵穿透试验检验精子体外授精能力失败的标本，采用显微注射技术可使精子辅助授精。结论：（１） 冷冻保存对附睾精子功能有显著的影响，造成精子功能减弱；（２） 冷冻精子仅用单一尾膜肿胀试验筛选，有可能拾取到的是尾膜完整，但头膜损伤的精子；（３） 建立显微授精技术可有效地对冷冻附睾精子辅助受精。

表皮生长因子受体介导的PLC-g1水解PIP_2的数学建模

目的探讨表皮生长因子刺激下磷脂酶C-g1(PLC-g1)水解细胞膜上PIP2(PIP2)的动力学特性。方法根据质量作用定律,利用微分方程对PIP2的代谢途径进行数学建模。结果建立了PIP2水解过程中关键产物浓度的微分方程,分析了各个参数对这些水解产物的影响。结论这个数学模型为进一步描述PIP2代谢循环的生物学特征和主要产物间浓度依赖关系的动态变化奠定了基础。

MTHFR基因C677T点突变的PCR-TGGE检测技术的建立

目的 :建立检测MTHFRC6 77T点突变的PCR -TGGE技术 .方法 :以中国人群外周血基因组DNA为模板 ,用聚合酶链反应扩增该基因外显子 4 ,用温度梯度凝胶电泳 (TGGE)分析检测PCR产物 ,对电泳结果异常者进行DNA测序 .结果 :垂直型TGGE与平行型TGGE均发现该外显子存在杂合性突变 ,经DNA测序证实为C6 77T点突变 .结论 :该技术具有快速、分辨能力高和重复性好的特点 ,是一种有效的检测核酸序列变异和点突变的技术 .

瘢痕疙瘩高危个体评估与p53基因第72密码子的多态性

目的:应用p53基因检测试剂盒观察不同的p53基因第72密码子多态性基因型及等位基因的表现频率,判断瘢痕疙瘩高危个体。方法:实验于2003-07/2004-10在南方医科大学细胞生物学实验室完成。采用聚合酶链反应-反向点杂交方法建立试剂盒,检测广东地区45例瘢痕疙瘩患者与60例正常对照者外周静脉血标本的p53基因第72位密码子多态性的基因型(脯氨酸/脯氨酸、脯氨酸/精氨酸、精氨酸/精氨酸)与等位基因(脯氨酸、精氨酸),观察不同分布对预测的意义,参与者均知情同意。结果:①脯氨酸/脯氨酸基因型频率:瘢痕疙瘩组明显高于对照组(20/44,15/25,P<0.036)。②脯氨酸等位基因频率:瘢痕疙瘩组明显高于对照组(56/62,57/48,P<0.034)。③脯氨酸/脯氨酸基因型者患瘢痕疙瘩的风险性:与脯氨酸/精氨酸+精氨酸/精氨酸基因型相比明显增高(比值比=2.400,95%可信区间:1.048～5.498)。结论:p53基因检测试剂盒检测出脯氨酸/脯氨酸基因型者患瘢痕疙瘩的风险性高,可以预测瘢痕疙瘩高危个体。