壳聚糖-海藻酸钠幽门螺杆菌全菌蛋白微球的制备及表征

目的以壳聚糖、海藻酸钠为主要材料包裹幽门螺杆菌(HP)全菌超声蛋白抗原,制备新型HP疫苗制剂。方法将海藻酸钠、壳聚糖、大豆油以及HP超声全菌抗原制备成W/O/W型微球。通过扫描电镜、粒径分布仪等检测微球粒径大小;药物溶出度仪、BCA蛋白试剂盒检测微球的蛋白包封率及药物释放速率。结果所制备的微球形态规则,平均粒径3.33μm;蛋白包封率约为64.8%;微球呈显著缓释模式,缓释时间可达6d。结论壳聚糖-海藻酸钠微球包裹全菌蛋白可以作为HP疫苗的新型缓释制剂。

壳聚糖-海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球疫苗制备工艺研究

目的改变壳聚糖-海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球制备中的各项参数,最终确认微球制备工艺。方法根据形成乳液的溶解性、流动性及黏稠度,选择微球制备过程中海藻酸钠(AGS)浓度及植物油与海藻酸钠的配比,通过比较形成微球的粒径大小,最终确定微球制备中CaCl2溶液的滴定程序及搅拌速率、搅拌时间等实验参数。结果确定了AGS乳液浓度为2%、植物油与AGS乳液配比为2∶8、CaCl2溶液反滴滴定法等MS制备工艺,并确定了搅拌速率800r/min、药物浓度2mg/ml、制备温度25℃、搅拌时间30min等参数。结论依照上述参数可以制备出符合实验要求的微球疫苗。

梅毒螺旋体特异性抗原TpN47基因片段的克隆与表达

目的在大肠埃希菌中表达梅毒螺旋体（Tp）TpN47（68-410aa）重组蛋白。方法采用PCR法从Tp全基因组中扩增TpN47（202—1230bp）片段，T-A克隆后构建原核表达质粒pET-22b（＋）-TpN47，经酶切鉴定后转化E coli BL21（DE3），IPTG诱导表达，表达产物经Ni^2＋亲和层析柱纯化，Westem blot鉴定其免疫反应性。结果PCR法扩增出约1000bp的目的片段，原核表达质粒pET-22b（＋）-TpN47经酶切鉴定正确，表达的蛋白约占菌体总蛋白的43％，相对分子质量约为39000，以包涵体形式存在。经纯化后蛋白纯度达95％以上，Western blot证实该蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应。结论所表达的TpN47重组蛋白具有良好的免疫反应性，为开发临床检测效果更好的梅毒诊断试剂盒奠定了实验基础。

新月柄杆菌RsaA分泌系统用于大肠杆菌胞外递送重组蛋白的初步研究

目的:构建基于新月柄杆菌RsaA外运机制的以大肠杆菌为宿主的原核胞外分泌表达载体系统。方法:利用分子克隆手段,按RsaA分泌系统操纵子组织方式,将RsaA系统外运功能基因配合以异源调控序列克隆至pQE30骨架质粒。以绿色荧光蛋白(GFP)为报告分子、大肠杆菌M15为宿主菌,诱导表达后通过Western Blotting检测培养上清中GFP的表达。结果:获得了与设计完全一致的pQABPS载体,利用该载体系统,在培养上清中报告分子GFP的表达明显增加,且是通过特异的RsaA外运机制被分泌至胞外的,而非渗漏表达或简单的信号肽引导。结论:在大肠杆菌中重现了RsaA分泌系统的外运功能,为该系统在基因工程领域的应用研究打下了良好基础。

肠出血性大肠杆菌O157：H7基因工程疫苗免疫小鼠的实验研究

目的研究肠出血性大肠杆菌O157：H7基因工程疫苗免疫小鼠后对该菌感染的保护能力。方法将60只BALB／c小鼠平均分为5组，分别为3种抗原单独免疫、三抗原联合免疫和PBS对照组，用注射方式免疫3次，抗原和佐剂均为每次100μg／只。采集免疫前和各次免疫后7d的小鼠血清检测抗体，末次免疫10d后以10^9CFU的O157全菌液经口感染小鼠。观察小鼠临床症状及死亡情况，检测粪便与肠道带菌情况，并作病理组织学检测。结果各抗原免疫组小鼠特异抗体明显增加，感染后各组小鼠均有死亡，IntiminC300、Stx2B、HlyAN436和联合免疫组保护率分别为73％、64％、36％和91％。未病死小鼠粪便排菌情况：对照组22d，实验组为5—14d。肠道带菌情况：对照组阳性率为100％，实验组为25％-83％。病死小鼠肺脏、肝脏均有明显组织病理学改变。结论IntiminC300、Stx2B和HlyAN436疫苗对于O157感染具有一定的预防作用，而联合免疫效果又大于单独免疫。

基于新月柄杆菌RsaA外运机制的EspA及EspA-IL-24融合蛋白胞外分泌表达研究

目的:实现大肠杆菌分泌蛋白(Esp)A及EspA与白细胞介素(IL)-24融合蛋白的胞外分泌表达,进一步验证基于新月柄杆菌RsaA外运机制的原核胞外分泌表达载体系统的有效性和通用性,并改造优化该系统。方法:利用分子克隆手段,按RsaA分泌系统操纵子组织方式,将获得的RsaA系统元件编码序列和异源调控序列克隆至pQE30骨架质粒,构建新的胞外分泌表达质粒pQABP2S;以大肠杆菌为宿主菌诱导表达EspA及EspA-IL-24融合蛋白,并通过Westernblot检测目标蛋白在培养上清中的表达。结果:获得了新的胞外分泌表达载体pQABP2S;与对照相比,该载体宿主系统培养上清中目标蛋白EspA及EspA-IL-24的表达量明显增加。结论:在大肠杆菌中通过RsaA分泌系统可实现分子大小不同的EspA及EspA-IL-24融合蛋白的特异性分泌表达,进一步证实该分泌表达策略的有效性和通用性;调整调控序列以优化分泌系统的尝试,为此类基因工程技术平台的开发提供了借鉴。