幽门螺杆菌对天然植物成分诱导耐药反应的实验研究

目的探讨幽门螺杆菌(HP)是否会对乳香胶、大蒜油和黄连提取物产生耐药。方法采用多步诱导法进行HP的体外耐药试验,另选临床耐药率很高的甲硝唑和目前抗HP疗效好的克拉霉素作同步试验;观察在药物浓度逐渐增加的培养基上转种的HP最低抑菌浓度(MIC)的变化,将敏感性下降的诱导株在无药培养基上转种3次后检测MIC值,测定乳香胶、大蒜油和黄连提取物对甲硝唑敏感性下降诱导株的MIC值。结果在多步诱导培养过程中,未诱导出对乳香胶、大蒜油和黄连提取物耐药的HP菌株,而在含64倍MIC甲硝唑的培养基上菌株仍能生长。在培养过程中,菌株对甲硝唑的敏感性逐渐下降,MIC值逐渐升高至64μg/mL;甲硝唑耐药株(MR)在无药培养基上转种10次后得到的MR'的MIC值不变。乳香胶、大蒜油和黄连提取物对MR的MIC没有影响。结论HP对乳香胶、大蒜油和黄连提取物不易产生耐药性,且甲硝唑耐药株对三者仍保持敏感。乳香胶、大蒜油和黄连提取物是有良好开发前景的抗HP感染的天然药物。

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白分子内佐剂融合疫苗的构建、纯化及活性研究

目的构建幽门螺杆菌(HP)中性粒细胞激活蛋白基因(napA)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(heat-labileenterotoxinBsubunit,LTB)的分子内佐剂融合蛋白疫苗,并通过口服免疫小鼠研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础。方法利用分子克隆技术构建携带napA-LTB融合基因的重组原核表达质粒pET-22b-napA-LTB,转化E.coliBL21(DE3),进行原核表达,重组表达蛋白采用亲和层析柱ChelatingSepharose进行纯化,Tris-Tricine电泳和Westernblot鉴定,GM1-ELISA检测rNAP-LTB与神经节苷脂的结合。口服免疫BALB/c小鼠,检测重组融合蛋白的抗原性。结果重叠延伸PCR扩增出了约760bp的napA-LTB融合基因,其核苷酸序列与GenBank公布的相关序列一致。重组融合蛋白以可溶和包涵体两种形式表达,表达量约占细菌总蛋白的30%,Tris-Tricine初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约29000,纯化后纯度大于90%。Westernblot检测其具有良好的抗原性。该重组蛋白保持了与GM1神经节苷脂结合的生物学活性。动物实验表明,分子内佐剂疫苗口服免疫小鼠后血清特异性IgG,IgA和胃黏液、肠黏液的抗原特异性sIgA抗体显著高于无佐剂单一亚单位疫苗。结论所获得的重组融合蛋白具有良好的抗原性和黏膜佐剂活性,为进一步的疫苗研究奠定了基础。

幽门螺杆菌分子内佐剂三价疫苗的构建、纯化及活性研究

目的构建幽门螺杆菌(helicobacterpylori,Hp)中性粒细胞激活蛋白基因napA、黏附素hpaA、尿素酶B亚单位活性功能片段ureB414与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(heat-labileenterotoxinBsubunit,LTB)的分子内佐剂三价融合蛋白疫苗,并通过口服免疫小鼠研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础。方法利用分子克隆技术构建携带napA-hpaA-ureB414-LTB融合基因的重组原核表达质粒pET-22b-NHUL,转化E.coliBL21(DE3),进行原核表达,重组表达蛋白采用HK26/60Superdex-75分子筛和亲和层析柱ChelatingSepharose进行纯化,Tris-Tricine电泳和Westernblot鉴定,GM1-ELISA检测rNHUL与神经节苷脂的结合。口服免疫Balb/c小鼠,检测重组融合蛋白的抗原性。结果重叠延伸PCR扩增出了约1590bp的NHUL融合基因;其核苷酸序列与GenBank公布的相关序列一致。重组融合蛋白以可溶和包涵体两种形式表达,表达量约占细菌总蛋白的25%,Tris-Tricine初步测定目的蛋白的Mr约59000,纯化后纯度大于90%。Westernblot检测其具有良好的抗原性。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性。动物实验表明,多亚单位疫苗口服免疫小鼠后血清特异性IgG、IgA和胃黏液、肠黏液的抗原特异性sIgA抗体显著高于单一亚单位疫苗。结论所获得重组融合蛋白具有良好的抗原性和黏膜佐剂活性,为进一步的疫苗研究奠定了基础。