小鼠骨髓树突状细胞的体外诱导培养及生物学特性分析

目的探讨从小鼠骨髓中体外诱导培养树突状细胞(DC)的可行性并进行生物学特性分析与鉴定。方法用重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)体外诱导小鼠骨髓细胞分化为树突状细胞,倒置显微镜动态观察形态学变化,扫描电镜观察其表面形态特征,流式细胞术分析细胞表面分子,同时进行抗原吞噬功能和刺激初始型T淋巴细胞增殖能力的检测。结果经体外诱导培养可获得大量未成熟和成熟DC,出现典型树突状形态。未成熟DC的细胞表型为CD11chigh、MHCⅡlow、CD86low,具有极强的抗原吞噬能力;未成熟DC经LPS刺激培养后可转变为成熟DC,细胞表型为CD11chigh、MHCⅡhigh、CD86high,可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖。结论体外诱导培养可获得小鼠骨髓来源的未成熟和成熟DC。

单纯疱疹病毒1型特异性表位的串联表达及免疫性质的研究

目的:串联重组表达单纯疱疹病毒1型(HSV-1)特异性表位,以获得具有抗原反应性能用于HSV-1鉴别诊断的抗原。方法:采用DNA重组技术将HSV-1特异性表位gG112-127进行串联,获得不同倍数重复串联的基因片段。将含有不同重复倍数的基因片段与表达载体连接,转化至宿主细胞JM109,异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷诱导,SDS-PAGE分析其表达,W estern印迹分析其抗原反应性。结果:获得了4×、8×、16×、32×重复串联的阳性重组子。其中8×重组子在JM109细菌中得到了17.5%的表达,其表达产物主要以包涵体形式存在。W estern印迹显示此重组蛋白能与HSV-1抗血清发生抗原抗体反应,而不与HSV-2抗血清发生抗原抗体反应。结论:HSV-1-gG112-127重组蛋白可作为HSV-1特异性检测的抗原来鉴别诊断HSV-1和HSV-2的感染。

重庆市及三峡库区家畜中大肠杆菌O157带菌的流行病学调查

采集重庆市及三峡库区6个区县家畜粪便样品1 473份,接种mEC+n增菌肉汤37℃振摇孵育6 h,取增菌液接种CT-SMAC平板,37℃培养18 h,挑取可疑菌落,经血清学检验、PCR扩增和微量生化实验确认,最后用药敏试纸测试其对常用抗生素的敏感性。结果表明,在1 473份粪便样品中共检出11株O157,其中7株O157:H7,4株O157:H?;对分离菌株做药物敏感性试验,发现它们对青霉素、氨苄西林、杆菌肽、头孢呋肟、红霉素、庆大霉素、四环素等存在不同程度的耐药。这次调查为重庆市及三峡库区该病的预防提供了依据。

幽门螺杆菌双亚单位表位融合蛋白的构建、表达及鉴定

目的构建和表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)黏附素(HpaA)和尿素酶B亚单位(UreB)表位串联体(HUepi)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白(HUepi-LTB),并对其进行纯化和鉴定。方法采用PCR技术分别扩增HpaA-UreB表位多肽编码基因HUepi和LTB的编码基因LtB,重叠延伸PCR将2段基因拼接起来,T-A克隆后构建融合基因表达质粒pET-22b(+)-HUepi-LtB,经酶切鉴定后转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,采用阳离子和阴离子交换层析进行纯化,PAGE检测、N端测序和westernblotting、ELISA检测、GM1活性检测。结果成功构建表位串联体(HUepi)与LTB融合蛋白的高效表达质粒pET-22b(+)-HUepi-LtB,重组工程菌pET-22b(+)-HUepi-LtB/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约20.7×103,破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达97%,免疫学鉴定该融合蛋白与兔抗LTB抗血清可以发生特异性的结合。结论HpHpaA-UreB表位串联体(HUepi)与LTB融合蛋白(HUepi-LTB)经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性。为新一代Hp疫苗的研制奠定基础。

基于HSV-1型特异性表位的血清抗体ELISA检测方法建立与初步应用评价

目的建立并评价HSV-1型特异性抗体鉴别诊断的ELISA方法。方法以HSV-1-gG112-127型特异性表位的串联重组表达蛋白作为包被抗原,建立检测血清HSV-1特异性IgG的间接ELISA方法。同时以免疫印迹检测作为“金标准”,评价检测方法的真实性和可靠性。结果采用棋盘法确定了包被抗原、抗体的最佳浓度,建立ELISA检测方法。血清特异性IgG检测的灵敏度为91%,特异度为97.6%,阳性预测值为97%,阴性预测值为93%,符合率为94.5%,试验的一致率为98%。结论用串联重组蛋白作为包被抗原对HSV-1感染的血清进行ELISA分型检测,其特异性好。

单纯疱疹病毒型特异性的鉴别诊断

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)分为HSV-1、HSV-2两个型别。两型的DNA有50%的同源性。目前血清学检测无法区分HSV型别。有效地鉴别HSV两型对疾病的诊断治疗和患者的身心健康至关重要。现对Ⅰ、Ⅱ型单纯疱疹病毒的鉴别诊断方法作一综述。

产志贺毒素大肠杆菌stx2a和stx2b的血清和牛奶抗体检测

于新桥医院采集健康人群血清535份,两个屠宰场采集商品猪血清415份,5家奶牛场和1家奶站采集新鲜牛奶326份,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清(牛奶)中的stx2a和stx2b抗体.用P/N>2.1作为阳性判定标准,535份健康人群血清检测到stx2a抗体阳性和stx2b抗体阳性血清各21份(3.93%);415份商品猪血清检测到stx2a抗体阳性血清4份(0.96%),stx2b抗体阳性血清2份(0.48%);326份新鲜牛奶检测到stx2a抗体阳性血清25份(7.46%),stx2b抗体阳性血清21份(6.44%).牛奶中stx2抗体阳性率最高,健康人群血清次之,商品猪血清的阳性率最低.由此表明重庆市STEC菌株中携带stx2基因.

重组幽门螺杆菌AhpC基因的克隆表达及其初步纯化

目的克隆表达幽门螺杆菌(helicobacter pylori)AhpC基因,为筛选预防或治疗幽门螺杆菌的疫苗保护性抗原奠定基础。方法用PCR方法从临床分离株9806的染色体DNA中扩增出AhpC基因片段,将目的基因插入表达载体pET-11c中,重组载体pET-AhpC经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。采用阴离子交换层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果PCR扩增的AhpC基因长度为597bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因片段与GenBank公布的序列相似性达98%,SDS-PAGE显示,经IPTG诱导目的蛋白占总蛋白的28.7%,经纯化后,蛋白纯度达70%以上。Western blot检测该蛋白与兔抗Hp的多克隆抗血清发生结合反应。结论成功构建了AhpC表达载体pET-AhpC,并在大肠杆菌中高效表达。

肠出血性大肠埃希菌O157:H7 espA基因的克隆与表达

目的通过DNA重组技术表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的EspA蛋白,并分析其免疫学性质。方法采用PCR技术从EHEC O157:H7基因组中扩增espA基因,T／A法克隆,连接至pET-28a(+)载体上,转化宿主细胞E．coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析法纯化目的蛋白, SDS-PAGE测定其相对分子质量,同时分析其N端氨基酸序列,免疫家兔鉴定其抗原性。结果重组espA基因片段的测序结果与GenBank上基因序列只有1个碱基不同,一致性为99．83％,所编码的氨基酸序列没有改变。重组EspA蛋白在工程菌中以包涵体的形式表达,表达量约30％。免疫家兔所得抗体滴度为1:32。结论构建高效表达EspA蛋白的重组载体pET-28a(+)-espA,表达的蛋白具有良好的免疫原性,为进一步制备亚单位疫苗奠定基础。