单细胞测序在造血系统研究中的应用与展望

目的单细胞测序(single cell sequencing,SCS)是一项在细胞个体层面进行精准化分析的技术。它提供了全新的角度去识别单个细胞的种类、功能、状态,以及与其他细胞的相互关联,极大深化了人们对细胞异质性、基因与分子功能多样性等方面的理解。随着各个技术环节的不断优化,SCS技术已广泛应用于多个研究领域,其中造血系统研究便是该技术运用的范例。SCS不仅在基础研究中,协助完成了生理和病理生理条件下的相关造血细胞图谱的构建,探索了血细胞发育分化的可能路径,而且在临床诊治过程中,有效推动疾病发生、进展和转归等机制的破解,促进个体疗效差异显著、易于复发等现象的潜在因素的挖掘。现就SCS的技术概况、发展趋势及其在造血系统的应用进行评述,以期为后续SCS技术的积极与合理应用提供参考。

我国放射复合伤创面处理与创伤促愈的研究历程

放射复合伤常见于战时核武器爆炸、平时核事故、贫铀武器伤害、次生伤害和恐怖伤害等情况,其伤情严重、种类复杂、救治困难,成为临床难点之一。复合伤有复合效应,因合并放射损伤因素的同时涉及伤口或创面等伤害,既不同于单纯的烧伤或创伤,也不同于单纯的急性放射病,远比单一损伤救治面广、矛盾多、难度大,必须充分吸取单一损伤的治疗经验和措施,及时能动地应用于复合伤研究。本文结合既往实验研究结果,重点总结放射损伤复合烧伤或创伤时创面处理的经验、方法与原则,创伤难以愈合的机制与促进愈合的措施,拟为此类核与辐射突发事件的应急处置提供技术储备。

放射复合伤的研究进展与展望

放射损伤合并烧伤、冲击伤、创伤等不同性质致伤因素所致复合性损伤称为放射复合伤,是战时核爆炸与平时核事故等情况下发生的一种重要的、特殊的损伤,其救治是一个突出的医学难题。近年来,相关机构围绕放射复合伤的复合效应机制与救治策略开展了持续深入研究。在药物防治方面,已经筛选鉴定出多种有效提升动物存活率的治疗用药,并且联合用药的理念已得到验证。在其难愈创面促愈方面,细胞治疗及以炎症调控为思路的干预手段均取得较好效果。后续需要将新理论、新方法、新模型等引入放射复合伤领域,从而持续深入推进其研究。

长期摄入含贫铀的饲料对雄性大鼠的遗传毒性研究

目的:大鼠长期食入一定剂量的贫铀后是否会产生遗传毒性.方法:给予初断乳大鼠含贫铀饲料,摄入的剂量分别为0,0.4,4,40mg/(kg·d),4mo后,观察亲代(F0代)和子代(F1代)大鼠精子畸形率,骨髓细胞微核率的改变,用单细胞凝胶电泳法研究贫铀对精子DNA的损伤程度.结果:摄入小剂量贫铀的F0代大鼠精子畸形率和彗星细胞的各指标与正常组差异无统计学意义(P>0.05).但中、高剂量组F0和F1代的精子畸形率、骨髓细胞微核率和彗星细胞率均增加(P<0.01),并与摄入贫铀的剂量和摄入时间呈一定的相关关系.结论:长期摄入一定剂量的贫铀可对大鼠产生遗传毒性.

骨髓嵌合促进Lewis肺腺癌细胞体内生长及转移的实验研究

目的研究骨髓移植对近交系C57BL/6(C57) 6～8周龄的野生雌性小鼠皮下接种Lewis肺腺癌细胞成瘤及转移能力的影响。方法采用随机数字表法抽取20只野生小鼠作为受体小鼠,通过8 Gy全身照射破坏受体小鼠骨髓造血系统,再通过尾静脉注射向受体小鼠移植正常小鼠的骨髓细胞,建立骨髓嵌合小鼠模型。随后将其分为对照B组和荷瘤组(每组10只),再使用随机数字表法取20只同批次未处理的野生小鼠分为对照A组和荷瘤组(每组10只)。分别向骨髓嵌合小鼠和野生小鼠背部皮下注射Lewis肺腺癌细胞获得皮下荷瘤模型,通过比较起瘤时间,肿瘤增长速度,离体瘤质量及肝、肺的转移情况,评价骨髓移植对C57BL/6小鼠皮下荷瘤模型的影响。结果皮下荷瘤后,骨髓嵌合小鼠较正常小鼠起瘤时间提早2 d,接种后第5天即可触及肿瘤;相同荷瘤时间,骨髓嵌合小鼠肿瘤体积增长更快,且离体瘤质量增加49. 27%(P <0. 01),并可观察到肺部有明显的肿瘤细胞转移。结论骨髓嵌合后C57小鼠相对正常C57小鼠更适于皮下荷瘤造模,其肿瘤生长更大,更容易发生转移。

高温高湿环境暴露对重度放创复合伤小鼠损伤恢复的影响

目的研究重度放创复合伤(R-W-CI)小鼠暴露于高温高湿环境(HHE)不同时间对小鼠存活率、造血损伤恢复、创面愈合及其病理学的影响。方法HHE模拟实验舱参数设定为温度(36±0.5)℃,相对湿度(70±5)%,通过肛温测评小鼠HHE暴露的效果。采用60 Coγ射线6.0 Gy全身照射,建立小鼠重度骨髓型急性放射病模型;照射后1.0 h内用刀片制成体表面积2.0%皮肤创伤模型。两种模型小鼠均于致伤前1.0 h放入模拟舱,转运与照射均由便携式高温高湿模拟舱维持HHE,致伤完毕后置于高温高湿模拟舱1.0 h和7.0 h后取出按常规条件饲养。急性放射损伤小鼠分为4组,即正常对照组(NC组)、放射损伤组(R组)、放射损伤HHE暴露1.0 h组(R+HHE 1.0 h组)、放射损伤HHE暴露7.0 h组(R+HHE 7.0 h组)。观察不同HHE暴露时间(1.0 h和7.0 h)对损伤后小鼠肛温、存活率、体重及外周血变化的影响。重度放创复合伤小鼠于伤后给予常规补液、创面包扎或左氧氟沙星(LEV)抗菌治疗,分为7组,即正常对照组(NC组)、放创复合伤组(R-W-CI组)、放创复合伤左氧氟沙星治疗组(R-W-CI+LEV组)、放创复合伤HHE暴露1.0 h组(R-W-CI+HHE 1.0 h组)、放创复合伤HHE暴露7.0 h组(R-W-CI+HHE 7.0 h组)、放创复合伤HHE暴露1.0 h左氧氟沙星治疗组(R-W-CI+HHE 1.0 h+LEV组)、放创复合伤HHE暴露7.0 h左氧氟沙星治疗组(R-W-CI+HHE 7.0 h+LEV组)。观察不同HHE暴露时间小鼠存活率、体重、外周血、创面愈合以及病理学指标变化。结果模拟实验舱设定HHE条件对小鼠的体温能够产生显著影响,达到HHE效果。HHE不同暴露时间对重度骨髓型急性放射病小鼠的体重恢复有不同影响,但对存活率无影响。在无左氧氟沙星抗菌治疗时,R-W-CI+HHE 1.0 h组小鼠存活率(40%)显著优于R-W-CI组(20%)(χ^(2)=5.496,P=0.019),但与R-W-CI+HHE 7.0组(30%)无显著差异。左氧氟沙星抗菌治疗能显著提高R-W-CI+LEV组与R-W-CI+HHE 1.0+LEV组小鼠存活率,但对R-W-CI+HHE 7.0+LEV组无明显影响。致伤后28 d,R-W-CI+HHE1.0 h+LEV组白细胞恢复显著优于R-W-CI+LEV组(F=6.549,P=0.021)和R-W-CI+HHE 7.0 h+LEV组(F=11.901,P=0.05)。R-W-CI+HHE 7.0 h+LEV组小鼠创面愈合显著延迟,而R-W-CI+HHE 1.0 h+LEV组小鼠创面愈合显著加快。结论HHE短时间(1.0 h)暴露有利于重度放创复合伤恢复,HHE长时间(7.0 h)暴露与之相反;抗生素治疗是有助于改善放创复合伤预后的基础支持疗法。

肠干细胞调控与肠道放射损伤修复的研究进展

肠道是放射损伤的重要靶器官,其损伤修复程度直接影响放射复合伤及其他肠道放射损伤患者的病情转归,目前临床尚缺乏有效的防治手段。肠道干细胞调控在放射性肠损伤的发展进程中居于核心地位。对肠道干细胞鉴定、信号调控、再生修复病理过程和相关药物靶点筛选等方面的研究,可为治疗相关疾病提供参考。

造影剂诱导肾小球内皮细胞凋亡的caspase-3机制

目的研究半胱氨酸蛋白水解酶caspase-3在非离子型低渗造影剂诱导肾小球内皮细胞凋亡中的作用,探讨非离子型低渗造影剂诱导肾小球内皮细胞凋亡的可能机制。方法DNA凝胶电泳分析不同浓度的非离子型低渗造影剂碘佛醇(ioversol)诱导肾小球内皮细胞凋亡情况,Westernblot分析caspase-3活化片段蛋白的表达变化,AnnexinV荧光染色和流式细胞检测caspase-3特异性阻断剂对细胞凋亡的抑制作用。结果高浓度的碘佛醇作用24h后,DNA凝胶电泳呈现典型的凋亡梯状条带,肾小球内皮细胞caspase-3活化片段蛋白表达明显升高,其升高幅度与碘佛醇浓度密切相关;AnnexinV荧光标记染色发现,caspase-3特异性阻断剂可以明显减轻碘佛醇诱导的肾小球内皮细胞凋亡。结论非离子型低渗造影剂诱导肾小球内皮细胞凋亡与caspase-3的活化有关,肾小球内皮细胞凋亡可能参与了造影剂肾病的发生。

低氧环境对小鼠急性放射损伤的影响

目的通过建立低氧急性放射损伤动物模型研究低氧对急性放射损伤的影响,为高原急性放射损伤救治提供实验依据。方法模拟高原4000 m海拔低氧环境,建立C57小鼠低氧急性放射损伤模型。将150只8~10周龄C57雄性小鼠随机分配至常氧对照组、常氧放射组、缺氧对照组、预缺氧放射组、持续缺氧放射组,每组30只。进行辐照生存率实验,记录不同时间点小鼠体重和精神状态,辐照后第3、7、14、21天血浆低氧诱导因子-1α(HIF-1α)含量、血常规、骨髓有核细胞计数和骨髓病理;检测辐照后第3、7天血浆促红细胞生成素(EPO)和转化生长因子β(TGF-β)含量。结果辐照后第3、7、14、21天,持续缺氧放射组出现明显骨髓组织损伤,持续缺氧放射组血浆HIF-1α含量较常氧放射组升高(q=4.660、3.346、4.978、6.759,P<0.05),表明低氧急性放射损伤模型建立成功。预缺氧放射组与常氧放射组、持续缺氧放射组相比,小鼠生存率明显提高;辐照后第7、14、21天外周血白细胞、淋巴细胞在恢复期升高更快,骨髓病理损伤更轻,骨髓有核细胞计数更多,同时辐照后小鼠体重增长更快。辐照后第3、7天,持续缺氧放射组血浆EPO含量及TGF-β含量较预缺氧放射组高(q=4.851、4.445,P<0.05;q=5.220、5.824,P<0.05)。结论预缺氧处理可能减轻急性放射损伤,而辐照后继续缺氧处理可能不利于急性放射损伤的恢复。

辣椒素对造血干细胞稳态的影响

目的 观察辣椒素对造血干细胞稳态的影响,并初步探讨其相关机制。方法 采用8～10周龄C57BL/6J小鼠,按随机数字表法分成实验组和对照组,分别给予0. 4 mg/d辣椒素溶液和单纯溶剂灌胃建立动物模型。采用流式细胞术检测造血干细胞稳态变化。利用流式分选得到原代造血干细胞进行q-PCR,分析周期相关蛋白激酶CDK2、CDK6 mRNA表达水平。利用CD45. 1小鼠作为受体进行造血移植实验。结果 流式细胞术分析结果显示,实验组造血干/祖细胞（LSK）比例较对照组明显升高[（0. 299±0. 041）%vs（0. 177±0. 052）%,P 〈0. 01]。亚群分析显示,与对照组比较,实验组短期造血干细胞（ST-HSC）比例上升[（47. 48±3. 22）%vs（37. 63±1. 85）%,P 〈0. 01],造血祖细胞（MPP）比例下降[（40. 59±3. 04）%vs（50. 12±1. 95）%,P 〈0. 01]。周期分析结果显示,与对照组比较,实验组造血干/祖细胞增殖,G0期细胞数目下降。q-PCR结果也证实实验组CDK2、CDK6 mRNA表达增强。凋亡和竞争性骨髓移植结果两组差异无统计学意义（P〉 0. 05）。结论 辣椒素促进造血干细胞增殖,灌胃辣椒素能致短期造血功能增强。

胶原支架结合脑源性神经营养因子移植促进全横断脊髓损伤大鼠轴突再生及运动功能恢复的研究

目的评价胶原支架结合脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)移植修复大鼠全横断脊髓损伤的效果。方法将32只成年雌性SD大鼠随机分成4组(n=8):A组为假手术组,只暴露T_9、T_(10)段脊髓;B、C、D组切除长4 mm的T_9、T_(10)段脊髓后,C、D组分别于损伤处植入相应长度的线性有序胶原支架(linear ordered collagen scaffolds,LOCS)和结合了胶原结合结构域(collagen binding domain,CBD)-BDNF的LOCS。术前及术后3个月内每周对大鼠进行BBB运动功能评分。术后3个月,实施神经电生理检测各组大鼠运动诱发电位(motor evoked potential,MEP);然后于L_2段脊髓组织注射荧光金(fluorogold,FG)实施逆行示踪,1周后取大鼠大脑及胸、腰段脊髓组织,脱水后观察脊髓组织形态;取包含损伤区的胸、腰段脊髓组织作切片。其中,脊髓冠状切片于激光共聚焦显微镜下进行观察,计算FG阳性细胞积分吸光度(IA)值;胸段脊髓组织水平切片采用免疫荧光染色,观察全横断脊髓损伤造模情况、脊髓损伤区轴突再生情况、D组再生轴突的突触形成情况。结果术后各时间点B、C、D组BBB评分均显著低于A组(P<0.05);术后2～12周D组BBB评分均明显高于B、C组(P<0.05)。电生理检测示,B组未观测到MEP;C、D组MEP潜伏期显著长于A组,C组显著长于D组,差异均有统计学意义(P<0.05)。脊髓组织形态观察示,B组脊髓损伤区域向两端延伸,损伤部位组织破坏严重;C、D组脊髓形态恢复较好,D组更接近正常组织形态。逆行示踪结果显示,各组大鼠损伤区以下的腰段脊髓灰质中均充满了FG阳性细胞;在损伤区以上的胸段脊髓中,A组FG阳性区域IA值显著大于B、C、D组(P<0.05),C、D组大于B组(P<0.05),C、D组间差异无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光染色示,自同一脊髓背侧至腹侧选出的组织切片显示了明显异于正常组织的全横断脊髓损伤区域。A组NF阳性轴突数明显多于B、C、D组,C、D组多于B组,D组多于C组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 LOCS结合CBD-BDNF移植可以促进大鼠全横断脊髓损伤后轴突再生以及后肢运动功能恢复。

成纤维细胞生长因子受体2对小肠上皮细胞增殖与分化的影响

目的探究成纤维细胞生长因子受体2(fibroblast growth factor receptor 2,Fgfr2)功能缺失对成年小鼠小肠上皮细胞增殖和分化的影响。方法繁殖和培育小肠上皮Fgfr2条件性敲除小鼠,经他莫昔芬(tamoxifen)诱导,Western blot验证Fgfr2在肠上皮的特异性基因敲除情况;将诱导肠上皮敲除Fgfr2的小鼠作为实验组,同胎野生型小鼠作为对照组。利用免疫荧光技术对潘氏细胞和内分泌细胞占肠上皮细胞的比例进行计数,利用Alcian染色对杯状细胞占肠上皮细胞的比例进行计数;运用HE染色和免疫组化染色指标推断小肠上皮Fgfr2功能缺失对小肠上皮细胞增殖的影响。结果经过转基因小鼠繁殖后诱导,Western blot检测结果显示小肠上皮特定敲除的Fgfr2小鼠构建成功;免疫荧光和Alcian染色结果显示:与对照组小鼠比较,Fgfr2敲除小鼠的十二指肠、空肠和回肠上皮潘氏细胞数量增加(P<0.05),杯状细胞数量减少(P<0.05),而内分泌细胞数量不变(P>0.05);HE染色和免疫组化染色结果显示:绒毛长度和隐窝深度以及增殖细胞数目未见明显变化(P>0.05)。结论 Fgfr2介导的微环境信号可参与调控成年小鼠小肠上皮分泌系细胞分化,但对小肠上皮细胞增殖无显著影响。

线粒体靶向小分子IR-61改善小鼠非酒精性脂肪肝

目的探讨线粒体靶向七甲川花菁类荧光小分子IR-61对小鼠非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)模型的治疗效果。方法通过喂养高脂饲料建立NAFLD小鼠模型,腹腔注射磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)或IR-61,治疗18周后,取肝脏组织切片HE常规染色,显微镜下观察,采用酶比色法检测肝脏和血清甘油三酯(triglyceride,TG)含量,Real-time PCR和Western blot法检测固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein 1c,SREBP-1c)、乙酰辅酶A羧化酶1(acetyl-Co A carboxylase-1,ACC1)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor-α,PPARα)和肉毒碱棕榈酰转移酶-1(carnitine palmitoyltransferase-1,CPT1)的mRNA及蛋白表达水平。结果 IR-61可降低高脂诱导的小鼠肝脏TG含量增加,抑制SREBP-1c、ACC1过度表达;同时增加肝脏PPARα、CPT1的表达(P<0.05);IR-61可明显改善小鼠肝脏的脂肪沉积。结论 IR-61通过抑制高脂诱导的脂肪合成代谢过度增强,促进肝脏脂肪酸氧化,减少肝脏甘油三酯沉积,从而改善非酒精性脂肪肝。

低氧习服在小鼠造血干细胞急性放射损伤修复中的作用观察

目的研究低氧习服在小鼠造血干细胞急性放射损伤后修复中的作用。方法采用随机数字表法将6~7周龄雄性C57BL/6J小鼠分为常氧辐照组和低氧习服辐照组。建立低氧习服急性放射损伤动物模型,低氧习服后再进行60 Co全身一次性照射6.0Gy。连续监测辐照前后小鼠尾静脉血血常规;流式细胞术检测低氧习服前后小鼠骨髓造血干细胞;取低氧习服小鼠长骨进行病理分析和VE-Cadherin免疫荧光染色;ELISA检测低氧习服小鼠低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管生成素-1(ANGPT1)。结果低氧习服加速辐照后小鼠外周血恢复,低氧习服辐照组外周血红细胞和血小板最低值高于常氧辐照组[(7.0±0.6)×10^(12)/L vs(5.1±0.4)×10^(12)/L,t=2.483,P<0.05;(203±30)×10^(9)/L vs(141±25)×10^(9)/L,t=2.541,P<0.05];低氧习服组骨髓LSK细胞和长期造血干细胞(LT-HSC)的比例及数量均高于常氧对照组[(3.91±0.21)‰vs(3.37±0.11)‰,t=2.536,P=0.032;(7.18±0.84)×10^(4)/L vs(6.01±0.82)×10^(4)/L,t=2.641,P=0.029;(12.05±0.53)%vs(9.37±0.45)%,t=3.512,P=0.023;(0.74±0.12)×10^(3)/L vs(0.58±0.11)×10^(3)/L,t=2.667,P=0.027]。低氧习服促进骨髓窦的增殖扩张和VE-Cadherin在窦内皮细胞的表达,减轻造血细胞凋亡和血管龛损伤;低氧习服组小鼠骨髓LSK细胞中HIF-1α和骨髓腔冲洗上清液中ANGPT1含量明显增加[(2.97±0.28)pg/cell vs(1.95±0.22)pg/cell,t=4.896,P=0.013;(12.30±3.70)pg/ml vs(6.25±2.70)pg/ml,t=6.742,P=0.001]。结论低氧习服减轻造血干细胞和血管龛的放射损伤,加快造血恢复,其原因可能与低氧习服调节LT-HSC比例,促进HIF-1α、ANGPT1在造血干细胞中的表达有关。

睡眠障碍对辐照后小鼠骨髓造血干细胞的影响

目的探讨睡眠障碍(sleep disorders,SD)对骨髓造血干细胞放射损伤的影响。方法采用6~8周龄C57BL/6J雄性小鼠56只,以^(60)Coγ射线对小鼠进行全身照射5.0、7.5 Gy。通过睡眠障碍仪建立SD模型,按照随机数表法,将小鼠分为对照组(Con组)、睡眠障碍组(SD组)、单纯照射组(IR组)、照后SD组(IR+SD组)、照后SD给磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)组(IR+SD+PBS组)、照后SD给GSK2795039组(IR+SD+GSK组)、照后SD给N-乙酰半胱氨酸(NAC)组(IR+SD+NAC组),共7组,每组8只。取小鼠尾静脉血,检测5.0 Gy受照后外周血变化;并观察7.5 Gy照后小鼠生存率。采用苏木精和伊红(HE)染色观察骨髓细胞致密性与细胞数量变化。通过流式细胞术,检测骨髓造血干细胞(LSK)的数量,以及凋亡水平和细胞周期变化,分析LSK的活性氧(ROS)、线粒体来源活性氧(mtROS)等指标。采用酶标仪检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+/NADPH)和谷胱甘肽(GSSG/GSH)观察LSK的氧化应激水平。采用流式细胞术,检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(NOX2)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的表达,分选小鼠LSK细胞,并采用聚合酶链式反应(PCR)检测NOX1-4、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、白介素18(IL-18)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)炎症因子的表达。结果与IR组相比,IR+SD组小鼠白细胞(WBC)和血小板(PLT)恢复显著减慢(t=4.39、6.37,P<0.05),骨髓细胞计数由(2.14±0.38)×107降至(3.59±0.29)×107(t=8.55,P<0.05),LSK细胞的G0期比例显著降低,凋亡比例显著升高(t=7.53、8.21,P<0.05),ROS、mtROS、NADP+/NADPH水平均显著升高(t=22.99、29.47、3.77,P<0.05)。IR情况下,SD进一步促进NOX2及Caspase-1活化及下游IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α炎症因子mRNA表达的升高(t=6.95、6.01、8.39、4.91、5.56,P<0.05)。抑制NOX2-ROS可以挽救SD诱导的照后造血损伤加重,从而显著减少LSK凋亡比例以及炎症因子表达,最终加速LSK的损伤恢复(t=9.24、3.92,P<0.05)。结论SD促进了IR介导的骨髓造血干细胞损伤,主要通过激活NOX2-ROS-Caspase-1轴使细胞内炎症因子和ROS水平升高,促进细胞凋亡,最终抑制骨髓造血恢复。