白细胞介素11基因治疗促进造血的实验研究

白细胞介素１１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１１，ＩＬ－１１）是一种具有广泛生物学功能的造血生长因子，体内体外实验均显示ＩＬ－１１具有显著的造血促进作用。为了探讨ＩＬ－１１基因治疗应用于造血功能低下疾病的可能性，构建了含人ＩＬ－１１ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体，并转染小鼠成纤维细胞系ＮＩＨ－３Ｔ３，经筛选获得３株高表达ＩＬ－１１的转染细胞亚克隆。用高表达ＩＬ－１１的转染细胞作为载体细胞，进行了ＩＬ－１１基因治疗对小鼠造血系统影响的实验研究。结果表明ＩＬ－１１基因治疗能显著提高正常小鼠外周血血小板水平；明显缩短亚致死量放射损伤小鼠白细胞降低的时间，促进外周血白细胞、血小板和红细胞压积的恢复。提示ＩＬ－１１基因治疗对于血小板减少性疾病治疗和放射损伤后的造血恢复具有潜在的应用价值。

逆转录病毒介导GM-CSF在造血祖细胞中的基因转移

为了探索GM-CSF基因治疗的可行性,采用逆转录病毒载体介导的基因转移方法将小鼠GM-CSF cDNA逆转录病毒pLXSN/GM转染病毒包装细胞PA317,然后感染富含造血干、祖细胞群体,经含G418的体外半固体造血祖细胞培养,表现出较多的G418抗性CFU-GM生成,用PCR和Southem Blot方法分别检测出转化细胞基因组中整合有Neo^R基因和GM-CSF cDNA,原位杂交显示转化细胞有较强的GM-CSF mRNA表达,在Dexter培养中,GM-CSF修饰组的成熟非粘附细胞计数明显高于对照组(P<0.05).上述结果表明GM-CSF重组逆转录病毒成功地转入造血祖细胞并获得了表达,为下一步体内基因治疗奠定基础.

小鼠IL－3 cDNA转化细胞移植体内表达的初步研究

随着基因治疗技术的发展和多个细胞因子基因的克隆，人们提出了供细胞因子的基因治疗的设想，以期为肿瘤、老年性痴呆、严重的造血功能障碍等这样一类难治疾病的治疗另辟蹊径。为改善放射损伤小鼠受抑制的造血功能，我们采用基因治疗的方法，将小鼠ＩＬ－３基因ｃＤＮＡ与逆转录病毒载体重组，转染包装细胞ＰＡ３１７，用其分泌的含ＩＬ－３ｃＤＮＡ的复制缺陷逆转录病毒感染、转化ＮＩＨ３Ｔ３细胞，从中筛选可在体外分泌ＩＬ－３的克隆，将可分泌ＩＬ－３的细胞种植到放射损伤小鼠体内后发现：受体小鼠血清中检出了ＩＬ－３的活性；其外周血白细胞计数升至５５万／ｍｍ３，以成熟中性粒细胞为主；肝、脾脏内有大量各个分化阶段的中性粒细胞。这些结果表明：可以利用基因治疗技术，在体内表达ＩＬ－３，改善机体的造血功能。

人胰岛素样生长因子-I 对高血压病人肠系膜动脉平滑肌细胞增殖周期的影响

目的在细胞水平研究高血压病人动脉血管平滑肌细胞（ＡＳＭＣ）的生长特性和体外血管活性物质对ＡＳＭＣ增殖作用的影响。方法应用复合酶法进行高血压病人ＡＳＭＣ分离，并用人胰岛素样生长因子Ｉ（ＨＩＬＧＦ－Ｉ）干预以观察人ＡＳＭＣ的增殖情况。结果经低浓度的ＨＩＬＧＦ－Ｉ作用，高血压病人ＡＳＭＣ呈典型的“谷”与“峰”样生长，经历了１０多个月传代培养至３５代。发现该细胞生长分裂活性活跃，与人胎儿脐动脉增殖活性相似。结论复合酶法能使高血压病人的ＡＳＭＣ的静止期缩短，传代后生长特征稳定性强，高血压病人体外培养ＡＳＭＣ的增殖有赖于ＨＩＬＧＦ－１的存在。

pS189／FLCⅢ—2诱变检测系统的研究

本文报道优选基于ＳＶ４０的短暂复制型穿梭质粒ｐＳ１８９和新生儿羊膜上皮细胞ＦＬＣⅢ—２亚克隆，组成穿梭质粒／哺乳动物细胞诱变检测系统。该系统中ＳｕｐＦ的自发突变型频率仅为１．７×１０－５，低于已报道的其它短暂复制型质粒和该质粒在其它细胞中复制时ＳｕｐＦ基因的自发突变率。各种剂量的ＭＮＮＧ的诱发突变频率随诱变剂剂量的增加而升高。ＭＮＮＧ对ＦＬ细胞毒性较大，仅０．３２μｇ／ｍｌ就可使ＦＬ几乎完全失去生长分裂形成克隆的能力，但在短时期内对依赖于病毒复制起点的ＤＮＡ复制效率影响不大，突变频率却显著升高。突变质粒的限制性内切酶分析和靶基因的ＰＣＲ分析等表明，检出突变大多数为点突变或微小缺失，该系统具有方便快速检出点突变的能力，可成为检测诱变剂、抗诱变剂作用强度和特性的分子检测系统。

水稻幼苗单株DNA的提取及其PCR-RAPD反应体系的建立

以杂交稻Ⅱ代63幼苗为DNA提取材料，建立了以所提取单株DNA为模板进行PCR－RAPD分析的最佳条件，获得稳定而理想的PCR扩增效果。

DNA芯片技术及其在基因表达检测中的应用

随着人类基因组计划的顺利进行，预计到２００３年人类可以完全测出自身的基因组序列。届时，人类将进入后基因组时代。探明人类全部基因的结构及其表达调控将成为后基因组时代的一个重要目标，而进行基因表达的检测则是研究基因功能的一个重要环节。人类如此浩翰的基因，...

内淋巴囊上皮细胞透明质酸合成酶mRNA的表达

目的 研究内淋巴囊上皮细胞透明质酸合成酶 (hyaluronansynthase)mRNA的表达及其意义。方法 在查阅核酸序列数据库基础上 ,采用Motif程序分析各物种 (大鼠、小鼠、爪蟾、人类 )透明质酸合成酶的保守序列 ,应用原位杂交技术检测透明质酸合成酶mRNA在内淋巴囊上皮细胞的表达。结果 内淋巴囊近侧端、中间部均有部分上皮细胞胞浆显示透明质酸合成酶mRNA的阳性表达。结论 在分子生物学水平证实了内淋巴囊上皮细胞能合成透明质酸。

人白细胞介素-3突变体的构建及在大肠杆菌中表达的研究

目的：为了在大肠杆菌中高效表达ｈＩＬ３ｃＤＮＡ，获得ｈＩＬ３蛋白，拟对天然型ｈＩＬ３进行构建以获得新的突变体，同时进行了活性测定，以便深入了解ｈＩＬ３的结构与功能之间的关系。方法：利用ＰＣＲ技术对天然型ｈＩＬ３Ｎ末端第３位蛋氨酸（Ｍｅｔ３）和Ｃ末端第１７位蛋氨酸（Ｌｙｓ１１６）进行定点突变，获得突变体ＭｈＩＬ３和ＭＶｈＩＬ３。结果：经Ｓｕｇｅｒ双脱氧法测序证实突变体ＭｈＩＬ３ｃＤＮＡ，ＭＶｈＩＬ３ｃＤＮＡ的活性为６．９×１０４Ｕ／ｍｌ，而天然型的是１．５×１０４Ｕ／ｍｌ。天然型ｐＳＭ５３ｈＮＩＬ３表达量占菌体总蛋白的７％，突变型ｐＳＭ５３ＭＶｈＩＬ３表达量占菌体总蛋白的１６％。结论：人ＩＬ３ｃＤＮＡ可通过ＰＣＲ技术进行定点突变。

复发尖锐湿疣中人乳头瘤病毒相关序列的检测

用聚合酶链反应及其产物斑点杂交技术，对２９例复发尖锐湿疣中人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）相关序列进行检测和分型，结果显示复发尖锐湿疣中：ＨＰＶ６：６５．５％，ＨＰＶ１１：２４．１％，ＨＰＶ１６：３１．０％，ＨＰＶ６／１１：１３．８％，ＨＰＶ６／１６：１０．４％，ＨＰＶ１８未检测出来，所用探针以外的型别：３．４％。

人促红细胞生成素cDNA逆转录病毒载体的构建及在NIH3T3和CHO细胞中的表达

贫血是慢性肾衰病人常见的症状,其发生的主要原因之一是由于肾脏表达促红细胞生成素(EPO)的量减少。输入基因工程重组的人EPO可以有效地改善病人的症状。由于在体内只有完全糖基化的EPO才有生理活性,所以目前临床所用EPO均来自工程化的哺乳动物细胞,价格昂贵。随着基因治疗研究的进展,人们设想可以采用基因治疗的方法,在体内表达一些有治疗作用的蛋白质。

人白细胞介素3突变体的构建及其在大肠杆菌中表达的研究

人白细胞介素3(IL-3)是与造血有关的细胞因子,可直接诱导人骨髓和外周血干细胞的集落形成和增殖。IL-3可通过高亲合力的结合位点对成熟骨髓效应细胞(巨噬细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞)发挥作用,可促进巨噬细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞的活力,延长存活期并抑制其死亡。rhIL-3还可提高巨噬细胞和嗜酸性细胞的细胞毒、杀菌以及杀癌细胞的能力。IL-3以非融合型蛋白难于在大肠杆菌中高效表达。本室应用遗传工程技术构建了pBV220

促红细胞生成素在酿酒酵母中的表达

促红细胞生成素(EPO)是一种特异刺激红系祖细胞向功能成熟的红细胞增殖分化的造血生长因子。重组人EPO(rhEPO)应用于临床治疗多种红细胞减少症取得了确切疗效。 酿酒酵母是迄今研究最为深入的真核生物之一,其遗传背景清楚,由此衍生的各种载体宿主菌表达系统较大肠杆菌载体宿主表达系统有更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力;

STAT6 G2964A基因多态性与哮喘关系的Meta分析

目的 研究信号转导和转录激活因子6（STAT6）基因多态性与哮喘易感性的关系。方法 通过数据库检索文献，确定文献纳入和排除标准，筛选文献，进行异质性检验和Hardy—Weinberg平衡检验，并确认文献的发表偏倚，然后应用Meta分析固定效应模型对STAT6 G2964A基因多态性与哮喘关系的文献进行定量综合分析。结果 共入选3篇文章，累计病例443例，其中STAT6基因突变阳性287例，对入选的3篇文献进行异质性检验，P〉0．05，文献没有异质性，合并OR值为0．81，合并OR值的95％可信区间为0．59～1．11。结论 通过本次研究，STAT6 G2964A基因多态性与人群哮喘易感性可能没有明显相关性。

基因突变的PCR技术

聚合酶链反应式（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）自８０年代中期由Ｍｕｌｉｓ发明基本方法以来，在研究应用过程中不断得到发展和完善，使这一技术广泛的应用于生命科学领域。如基础研究中的基因克隆、基因改造、突变及顺序测定；临床研究中的...

PCR技术对人IL-3 cDNA进行定点突变的研究

本文利用PCR技术对人IL-3cDNA体外进行定点突变,将人IL-3cDNA第3位Met,第116位Lys密码子突变为Val密码子GTT。PCR扩增片段核苷酸序列与引物设计相应的cDNA突变体序列完全一致。结果证实此方法比经典寡聚核苷酸方法简单、迅速、成本低、效率高,也为基因的修饰,蛋白质工程研究提供了简便、稳定的方法。

论人类基因治疗设计技能模型的误区

论人类基因治疗设计技能模型的误区第三军医大学分子生物学教研室博士生（重庆６３００３８）王燕导师朱锡华基因治疗就是将遗传物质转入机体细胞达到治疗疾病的目的。这种技术不仅对遗传病有着广阔的应用前景，而且对于一些获得性疾病也可能有很大的作用。目前，基因治疗...

TNFR与IL-1R胞外区融合蛋白空间结构的分析

TNF和IL-1是两种重要的炎性细胞因子,在休克、多器官功能衰竭和一些自身免疫性疾病的发生、发展中起着十分重要的作用,抑制它们的活性已经成为这些病理过程和疾病救治中的重要研究内容。目前已有的拮抗TNF和IL-1的方法存在着效果差、时间短等问题。为此,我们拟构建TNFR和IL-1R胞外区的融合蛋白,

白细胞介素－11对小鼠骨髓造血的影响

白细胞介素－１１（ＩＬ—１１）是一种新的造血生长因子，于１９９０年基因克隆成功．本文对ＩＬ—１１的造血调节作用进行了初步的研究，探讨了ＩＬ—１１及其与其它造血因子协同对小鼠骨髓造血祖细胞增殖的促进作用．结果表明，ＩＬ—１１单独对骨髓集落的形成无显著的促进作用，但与多系集落刺激因子ＩＬ－３一起则具有很强的协同作用，能明显促进小鼠骨髓Ｍｅｇ—ＣＦＵ和Ｍｉｘ－ＣＦＵ的形成．

豚鼠内淋巴囊上皮细胞Na^+,K^+-ATP酶不同β亚基的mRNA表达

目的 进一步研究内淋巴囊上皮细胞Na+,K+-ATP酶不同 β亚基的表达。方法 采用豚鼠内淋巴囊冰冻切片、原位杂交的方法检测Na+,K+-ATP酶不同 β亚基mRNA在内淋巴囊上皮细胞中的表达。结果 在内淋巴囊上皮细胞胞浆内可见Na+,K+-ATP酶不同 β亚基的阳性颗粒 ,β1亚基表达较弱 ,β2 亚基表达较强。结论 结合其他报道 ,内淋巴囊上皮细胞具有多种亚基异构体组成的Na+,K+-ATP酶的表达 ,而结肠上皮、肾小管上皮的Na+,K+-ATP酶几乎仅有α1β1型 ,提示其离子转运过程可能不同。