类固醇受体辅活化子-3在烧伤后T淋巴细胞功能抑制中的作用

目的探讨类固醇受体辅活化子（SRC）-3蛋白在严重烧伤后T淋巴细胞功能变化中的作用。方法健康SPF级雌性野生型（SRC-3＋/＋）小鼠、SRC-3基因敲除（SRC-3-/-）小鼠各10只,体质量约20 g,分为SRC-3＋/＋组（S组）和SRC-3-/-组（S-组）,每组分为正常（N）和24h两个时相点,每个时相点各5只。制作15%～20%Ⅲ°烧伤模型,按时脱臼处死小鼠,取股动脉血、脾脏和胸腺,并立即分离血浆和外周血、脾、胸腺淋巴细胞。测定血浆IL-2、可溶性IL-2受体（sIL-2R）表达和T淋巴细胞亚群的分布。结果两组正常小鼠血浆IL-2和sIL-2R水平没有显著差别,烧伤后24h均显著升高（P〈0.01）,但S-组小鼠血浆IL-2显著低于S组（P〈0.01）,而血浆sIL-2R显著高（P〈0.01）;正常情况下,S-组小鼠除脾脏CD8＋高于S组小鼠（P〈0.01）外,外周血、脾脏和胸腺CD3＋、CD4＋及CD4＋/CD8＋比值均不同程度低于S组小鼠（P〈0.05或P〈0.01）。烧伤后24h,两组小鼠外周血、脾脏和胸腺CD3＋、CD4＋及CD4＋/CD8＋比值均不同程度下降（P〈0.05或P〈0.01）,CD8＋显著增高（P〈0.05或P〈0.01）,与S组相比,S-组外周血、脾脏和胸腺CD3＋和CD4＋降低更显著（P〈0.01）,CD4＋/CD8＋比值差别均无统计学意义。结论 SRC-3蛋白可能与严重烧伤后T淋巴细胞免疫功能抑制有关,其蛋白缺失可引起T淋巴细胞亚群稳态的改变。

甘草酸18α体对缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞p21蛋白表达的影响

目的探讨甘草酸18α体对肾脏缺血再灌注损伤(IRI)后肾小管上皮细胞p21蛋白表达的影响及其意义。方法将成年(2月龄)野生型鼠[p21(+/+)]和p21基因敲除鼠[p21(-/-)]分成4组:p21(+/+)鼠生理盐水组和p21(+/+)鼠甘草酸治疗组,p21(-/-)鼠生理盐水组和p21(-/-)鼠甘草酸治疗组;左肾IRI模型建立:无创动脉夹阻断左肾动脉血流45min,开放动脉夹形成再灌注。于再灌注后0、1、7d处死实验动物,制作双肾(右肾作自身对照)标本,HE染色观察肾组织病理形态学变化;Westernblot定量检测p21蛋白表达的变化。结果缺血再灌注损伤肾脏主要表现为肾小管坏死,半定量分析发现甘草酸治疗组比生理盐水组轻,p21(+/+)鼠组比p21(-/-)鼠组轻(P<0.01)。在p21(+/+)鼠,甘草酸治疗组p21蛋白表达比生理盐水组显著增多(P<0.01)。p21蛋白表达与肾小管坏死呈显著负相关(P<0.01)。结论甘草酸主要通过对小鼠IRI肾脏p21蛋白表达的上调,减轻肾小管坏死,从而对IRI肾脏产生保护作用。

P53-P21-Rb信号通路在缺血再灌注损伤后期肾小管上皮细胞衰老中的作用

目的研究P53-P21-Rb信号通路在肾脏缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,IRI)后期肾小管上皮细胞衰老中的作用。方法建立P53(+/+)和P53(-/-)鼠单侧肾脏IRI模型,研究IRI后期不同时间点肾小管上皮细胞的衰老变化以及P52、P21和Rb蛋白表达的变化。结果P53鼠肾脏在IRI后期,肾小管上皮细胞衰老在IRI后3个月和6个月点显著增加(P<0.05);而P53(+/+)鼠对侧肾和P53(-/-)鼠双肾,在IRI后1个月和3个月点几乎没有出现肾小管上皮细胞衰老;P53(-/-)鼠的IRI肾在IRI后6个月点也只检测到少量衰老的肾小管上皮细胞,细胞衰老与P53、P21和Rb蛋白的表达有相关性(P<0.05)。结论P53-P21-Rb信号通路的激活在IRI诱导肾小管上皮细胞衰老的发生中可能发挥着重要作用。

20AA复方氨基酸联用大剂量维生素B6治疗创伤凝血障碍大鼠的实验研究

目的：探讨20AA 复方氨基酸注射液（丰诺安）＋大剂量维生素 B6新疗法对创伤性凝血功能障碍动物模型凝血功能的影响。方法实验动物为雄性 SD 鼠24只，随机分为假手术组、生理盐水组以及新疗法治疗组，每组8只。采用 Feeney′s 自由落体硬膜外撞击法加大腿骨折与放血制作大鼠多发伤模型，颈静脉插管输注20AA 复方氨基酸注射液（丰诺安）＋大剂量维生素 B6，生理盐水组输注等量的生理盐水，24 h 后，检测大鼠的凝血功能变化。结果治疗后新疗法治疗组与生理盐水组比较，血栓弹力图 R 值新疗法治疗组[（2．24±0．68）min]显著低于生理盐水组[（3．21±0．30）min]，（t ＝－0．98，P ＜0．05）；血栓弹力图 Angle 值新疗法治疗组[（81．98±1．78）deg]显著高于生理盐水组[（79．54±2．13）deg]，（t ＝2．43，P ＜0．05）。传统凝血试验结果：凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）新疗法治疗组均比生理盐水组低，而纤维蛋白原（FIB）新疗法治疗组高于生理盐水组，但其差异不显著。结论20AA 复方氨基酸注射液（丰诺安）＋维生素 B6联用能够明显改善创伤后大鼠凝血功能。

低强度聚焦超声对新生小鼠大脑皮层发育及星形胶质细胞活化的影响

目的 观察低强度聚焦超声(LIFU)对新生小鼠大脑皮层发育及星形胶质细胞活化的影响。方法 将80只新生小鼠分为LIFU组(n=48)和假手术组(n=32)。对LIFU组小鼠以LIFU连续波辐照3天、每天5 min;将假手术组小鼠置入声场中,不施加声波。采用蛋白质印迹法检测皮层NFIX蛋白表达,以免疫荧光染色观察c-Fos、NFIX及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达,以EdU染色观察皮层细胞增殖情况。结果 LIFU辐照后1.0、1.5、2.0、2.5及3.0 h, LIFU组小鼠大脑皮层c-Fos表达数量均较假手术组显著增加(P均<0.05),于1.5 h达峰,之后逐渐递减。辐照后1 h, LIFU组小鼠皮层NFIX蛋白表达量明显高于假手术组;辐照后1、2、3 h及1个月,LIFU组小鼠皮层NFIX数量均较假手术组明显增加(P均<0.05)。辐照后1个月,LIFU组小鼠大脑皮层GFAP阳性细胞数量明显增加,且细胞呈星形,从胞体发出大量长突起。辐照后16、24 h, LIFU组EdU阳性细胞数量较假手术组显著增多(P均<0.05),且增殖的EdU阳性细胞存在NFIX阳性细胞共表达。结论 LIFU可激活新生小鼠大脑皮层c-Fos表达,促进皮层中细胞增殖和GFAP星形胶质细胞增加,可能与NFIX有关。

慢性特发性荨麻疹患者外周血单个核细胞分泌IFN-γ和IL-4水平检测及意义

目的 探讨Th1 /Th2细胞因子水平变化在慢性特发性荨麻疹(CIU)发病机制中的作用。方法 采用ELISA法检测37例CIU患者外周血单个核细胞(PBMC)培养上清中的细胞因子IFN γ和IL 4。结果 CIU患者IFN γ水平低于正常对照组(P<0. 05),其浓度分别为170. 58±230. 28pg/ml及340. 76±220. 35pg/ml;CIU患者IL 4水平高于正常对照组(P<0. 05),其浓度分别为41. 53±12. 57pg/ml与27. 01±13. 54pg/ml。结论 Th2细胞功能亢进及Th1功能低下在CIU发生发展中可能发挥一定的作用。

罗格列酮对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外抗肿瘤作用

目的:研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂罗格列酮对人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外生长影响,以评价其在人乳腺癌治疗上的应用潜力.方法:噻唑蓝(MTT)法检测罗格列酮对MDA-MB-231细胞体外生长抑制作用;应用PPARγ拮抗剂GW9662,分析罗格列酮对MDA-MB-231细胞增殖影响与PPARγ受体关系;流式细胞仪分析细胞周期,Annexin V-FITC和TUNEL法检测细胞凋亡.结果:罗格列酮干预下MDA-MB-231细胞G0/G1期比例上升,而S期比例下降,呈量-效关系抑制其生长,IC50=5.2μmol/L.PPARγ拮抗剂GW9662可部分逆转罗格列酮对MDA-MB-231细胞增殖抑制作用(P<0.05);100μmol/L罗格列酮还可诱导MDA-MB-231细胞凋亡,TUNEL法检测的凋亡率(18.4±3.1)%与Annexin V-FITC法检测的结果一致[(16.6±2.7)%](P>0.05).结论:罗格列酮通过PPARγ介导,使MDA-MB-231细胞G1期阻滞而抑制其增殖,高浓度时还可诱导其发生凋亡,罗格列酮有望成为治疗乳腺癌的有效药物.

携带人PPARα基因高效真核表达载体的构建及其意义

目的构建可以高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体(αhPPARα)的真核细胞表达载体,为筛选作用于PPARα受体的药物提供分子平台。方法将HepG2细胞总RNA经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆hPPARα全长基因,用BamHⅠ、SalⅠ双酶切后,与相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建phPPARα-IRES2-EGFP重组质粒,用酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARα基因的完整性和可靠性;重组质粒转染293细胞,荧光显微镜观察EGFP报告基因表达强度,并对转染细胞的hPPARα表达进行荧光定量PCR及免疫细胞化学检测。结果经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPARα的高效表达。结论成功构建重组质粒phPPARα-IRES2-EG-FP,为基于hPPARα受体靶点的药物筛选平台的建立提供了高效表达hPPARα的重组载体。

维持性血液透析患者血管平滑肌细胞p53的表达与血管钙化的关系

目的探讨维持性血液透析患者血管平滑肌细胞p53的表达与血管钙化的关系。方法选择慢性肾脏疾病5期维持性血液透析患者17例(透析时间在1年以上),均为自体桡动脉-头静脉内瘘作为透析通路的患者,因自体动静脉内瘘失功拟重建血管通路。在动静脉内瘘重建过程中,取失功动静脉内瘘动脉段作为实验组标本,同龄人群(取材于尸体肾供者)腹主动脉作为对照组。以von Kossa染色法对血管钙化进行定性检测,甲酚酞络合酮化学法对血管钙化进行定量检测,磷酸苯二钠法测定血管组织碱性磷酸酶活性,Western blotting检测血管组织p53蛋白水平,并对血管钙含量和碱性磷酸酶活性与p53的表达进行相关性分析。结果维持性血液透析患者桡动脉血管平滑肌细胞p53的表达(p53/β-actin灰度比为0.81)显著低于同龄人群腹主动脉血管平滑肌细胞p53的表达(p53/β-actin灰度比为1.72),而血管平滑肌细胞钙含量和碱性磷酸酶活性分别较同龄人群腹主动脉血管平滑肌细胞增加69%和105%(P均<0.01)。相关性分析发现,p53的表达与血管平滑肌细胞钙含量和碱性磷酸酶活性均成显著负相关(r=-0.77和r=-0.86,P均<0.01)。结论在5期慢性肾脏疾病维持性血液透析患者中血管钙化广泛存在,血管钙化伴随着血管平滑肌细胞p53蛋白表达的显著下降,这一现象提示慢性肾脏疾病患者血管平滑肌细胞p53表达的抑制可能参与了血管钙化的发生机制。

人脐血源性MSCs成骨诱导分化后对DCs的免疫抑制研究

目的探讨人脐血源性间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood,UCB-MSCs)经成骨诱导分化后,对树突状细胞(dendritic cells,DCs)的分化、成熟及免疫功能的影响。方法对UCB-MSCs通过细胞形态、表面标记及成骨诱导分化能力进行鉴定;在外周血单核细胞培养体系中加入GM-CSF+IL-4+TNF-α,刺激DCs诱导分化及成熟;收集与成骨诱导分化前后UCB-MSCs共培养的DCs,流式细胞仪检测DCs免疫表型的表达情况;将成熟DCs作为刺激因素,外周血淋巴细胞作为反应细胞,3H-TdR标记β液体闪烁计数仪检测与成骨诱导分化前后UCB-MSCs共培养后,DCs刺激淋巴细胞增殖能力的变化。结果人UCB-MSCs成骨诱导分化后能抑制DCs表面CD40、CD80、CD83、CD86和MHC-II的表达,上调CD14的表达;DCs具有明显刺激淋巴细胞增殖的功能,而UCB-MSCs成骨诱导分化后能显著抑制DCs刺激的淋巴细胞增殖。结论成骨诱导分化的UCB-MSCs在体外可抑制同种异体DCs的分化、成熟及免疫功能,为UCB-MSCs作为同种异体源性种子细胞在骨组织工程中的应用提供了依据。

颅脑模型减速撞击过程中脑组织受力特点的研究

目的研究颅脑减速撞击过程中脑组织关键部位受力的特点(受拉或受压)。方法制作含气泡的透明颅脑物理模型,并将其固定在竖式颅脑减速撞击实验台上。将移动平台放置在400mm的高度,自由下落并撞击固定台面,同时采用高速摄像记录整个减速撞击过程,并用序列图片分析软件对气泡长、短轴(分别位于垂直于撞击方向及撞击方向)的轴长变化进行分析。结果撞击点处的气泡在短轴方向上的轴长变化大于长轴方向上的轴长变化,对冲点处的气泡在短轴方向上的轴长变化小于长轴方向上的轴长变化。结论实验结果表明撞击点处的气泡所受到的作用力主要为压力且来自于短轴方向,即撞击方向;对冲点处的气泡所受到的作用力主要为拉力且来自于长轴方向,即撞击方向的垂直方向。该结果对于研究颅脑减速撞击致伤的力学机制及其诊断和防护具有重要意义。

人脐血源性MSCs成骨诱导分化后的免疫调节作用

目的:探讨脐血源性间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)经成骨诱导分化后,其对淋巴细胞的免疫调节作用。方法:从人脐血中分离、培养及扩增MSCs,流式细胞仪测定细胞表型;将获得的MSCs在成骨诱导体系中诱导分化并鉴定,将诱导后的成骨细胞分别以不同剂量加入到外周血混合淋巴细胞培养体系和植物血凝素(PHA)刺激的外周血淋巴细胞转化体系中,用3H-TdR标记β液体闪烁计数仪检测细胞增殖,观察对混合淋巴细胞反应和淋巴细胞转化的影响。结果:从人脐血中分离获得的MSCs,呈成纤维样的细胞形态,CD29和CD105表达阳性,CD34和CD45表达阴性;在成骨诱导剂诱导下,具有成骨细胞样表型,可表达碱性磷酸酶,并形成矿化结节;人脐血源性MSCs经成骨诱导分化后在体外对混合淋巴细胞反应和PHA诱导的淋巴细胞转化均具有明显的抑制作用,抑制作用与细胞数量呈正相关。结论:脐血源性MSCs诱导为成骨细胞后对同种异体淋巴细胞具有免疫调节作用,为其作为骨组织工程异基因种子细胞来源打下基础。

重组人PPARα基因载体phPPARα-IRES2-EGFP高效体外转染表达体系的建立

目的建立体外phPPARα-IRES2-EGFP质粒高效转染并获得重组基因hPPARα高效表达的体系。方法采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将phPPARα-IRES2-EGFP转染入293细胞,荧光显微镜观察质粒转染的293细胞绿色荧光蛋白(GFP)报告基因表达强度及转染效率,并对转染细胞hPPARα的表达进行荧光定量PCR和Western Blot检测。结果荧光显微镜下可见转染phPPARα-IRES2-EGFP的293细胞GFP报告基因高表达,转染效率高达(83±9)%;并且,其hPPARαmRNA表达水平高于空载体转染对照组3个数量级,hPPARα蛋白表达也远高于对照组(P<0.01),说明导入的重组质粒能够高效表达hPPARα。结论成功建立重组质粒phPPARα-IRES2-EGFP高效体外转染表达体系,为hPPARα受体功能的研究及基于hPPARα为靶标的药物筛选平台的建立奠定了基础。

1例先天性脊柱骨骺发育不良患者COL2A1基因新突变

目的检测1例先天性脊柱骨骺发育不良(SEDC)患者基因的突变情况。方法根据临床表现和骨骼影像学诊断先证者为SEDC。收集患者血液标本,提取基因组DNA,采用PCR扩增COL2A1外显子,对所有外显子进行测序分析。结果患者短颈,椎体扁平,股骨颈结构不规则,髋臼顶扁平,脊柱侧弯。基因检测表明COL2A1基因42号外显子2735位核苷酸发生一个新的错义突变,由G变成A(c.2735G>A),使912号氨基酸由甘氨酸变成了天门冬氨酸(p.G912D)。结论在1例中国SEDC患者中发现了一个COL2A1基因新的错义突变p.G912D。

维生素B_6联用20AA复方氨基酸治疗创伤性凝血病的疗效及机制研究

目的探讨维生素B_6联用20AA复方氨基酸治疗创伤性凝血病有关机制。方法 114只雄性SD大鼠,按随机数字表法进行分组。创伤性凝血病大鼠模型建立实验使用60只大鼠,假手术组(10只),模型组(50只),其中模型组分别于造模后4 h,6 h,12 h,24 h和48 h时间点采集标本,每个时间点10只;新疗法疗效实验使用24只大鼠,分为假手术组,9%等渗盐水对照组,维生素B_6与20AA复方氨基酸联合治疗组,共3组,每组8只;新疗法作用机制实验使用30只大鼠,正常组3只、假手术组3只、新疗法组与对照组各12只,其中新疗法组与对照组分别在伤后4 h,6 h,12 h及24 h四个时间点采集标本,每个时间点3只。通过造成大鼠重型颅脑损伤、双股骨骨折、开腹及腹主动脉放血20%,制成大鼠多发伤模型,进行干预后,按各时间点采集标本进行相应检测。创伤性凝血病大鼠模型建立实验采用血栓弹力图检测凝血功能变化,新疗法疗效实验分别采用血栓弹力图与凝血4项检测检测凝血功能变化,新疗法作用机制实验采用实时定量PCR检测凝血因子基因表达变化。结果 (1)创伤性凝血病大鼠模型建立实验:R值(反应时间)48h达到高峰,24 h,48 h与正常组比较具有统计学差异(P<0.05),K值(血块生成时间)和Angle值(血块生成率)各组变化不大,与正常组相比较无统计学意义;MA(最大宽度值)4 h开始延长,48 h达到高峰,24 h,48 h与正常组比较具有显著统计学差异(P<0.01)。(2)新疗法疗效实验:新疗法组与对照组比较,血栓弹力图R值为(2.24±0.68)min,显著低于对照组的(3.21±0.30)min(P<0.05);新疗法组血栓弹力图Angle值为(81.98±1.78)°,显著高于对照组的(79.54±2.13)°(P<0.05)。传统凝血试验结果:凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)新疗法治疗组均比对照组低,而纤维蛋白原(FIB)新疗法治疗组高于对照组,但其差异不显著。(3)新疗法作用机制实验:与正常组相比,除FⅪ与FⅩⅢA亚基外,新疗法组和对照组的肝脏凝血因子基因表达明显上调,但随着造模时间延长,其表达水平逐渐下降;新疗法组与对照组相比,肝脏凝血因子基因表达水平更高,其差异具有统计学意义(P<0.05)。结论建立与临床基本相符的大鼠创伤性凝血病模型,利用该模型验证了维生素B_6联用20AA复方氨基酸疗法对创伤性凝血病大鼠凝血功能的改善作用,并发现该新疗法能够通过提高肝脏凝血因子基因mRNA表达水平,从而改善动物模型的凝血功能。

严重创伤后凝血病的新疗法

目的探讨严重创伤后凝血病的早期诊断与新疗法治疗的疗效。方法选取我院2007年1月至2014年12月收治的严重创伤合并凝血病患者64例,外院紧急会诊救治患者9例作为研究对象。分为对照组和治疗组,对照组采用相关综合治疗,治疗组在综合治疗基础上,采用20AA高支链肝病复方氨基酸注射液（丰诺安）联用大剂量维生素B6新疗法。观察患者15 d死亡率的变化。结果与对照组比较,治疗组死亡率得到显著降低,大出血一般在1.572 h逐步得到控制,最快的1例在静脉输入1 h就明显控制了大出血,肝功能都有明显好转。结论在综合治疗基础上采用20AA高支链肝病复方氨基酸注射液（丰诺安）联用大剂量B6新疗法对救治严重创伤后凝血病患者效果明显。

难愈性创面修复局部人血管内皮生长因子165真核表达载体的构建与评价

目的:克隆人血管内皮生长因子165cDNA并构建其真核表达载体,为放创复合伤的难愈性创面的促愈修复提供实验基础。方法:实验于2001-09/2003-05在第三军医大学创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。从白血病HL-60细胞提取总RNA,经过反转录-聚合酶链反应扩增编码人血管内皮生长因子165的cDNA序列,将其克隆至pMD18-T载体后进行测序鉴定,然后将该序列插入双顺反子的真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中。观察以下指标①反转录-聚合酶链反应扩增人血管内皮生长因子165cDNA。②阳性重组质粒pMD18-T-hVEGF165的筛选。③DNA测序鉴定。④阳性重组质粒pIRES2-EGFP-VEGF165的筛选。结果:反转录-聚合酶链反应扩增得到约600bp的目的DNA片段,酶切pMD18-T-hVEGF165得一与目的片段大小一致的条带,且测序分析其与GeneBank中报道的编码人血管内皮生长因子165cDNA序列完全一致。pIRES2-EGFP-hVEGF165的酶切电泳显示目的条带成功插入真核表达载体pIRES2-EGFP中。结论:成功构建了含有人血管内皮生长因子165cDNA的真核表达载体,如果通过转基因技术可提高血管内皮生长因子165在放创复合伤难愈性创面的局部的表达,有望为修复难愈创面开辟一条新的途径。

含人过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因高效真核表达载体的构建及其意义

目的构建高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体δ(hPPARδ)的真核表达载体,为hPPARδ受体功能和基于hPPARδ受体靶点的药物筛选提供分子研究平台。方法采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),从HepG2细胞总RNA克隆hPPARδ全长基因,与经BamHI、SalI相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建重组质粒phPPARδ-IRES2-EGFP,经酶切及基因测序鉴定重组质粒中hPPARδ基因的完整性和忠实性;荧光显微镜观察重组质粒转染的293细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞hPPARδ的表达进行荧光定量PCR和免疫细胞化学检测。结果经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPAR6的高效表达。结论成功构建phPPARδ-IRES2-EGFP重组质粒。

携带人PPARγ1受体基因高效真核表达载体的构建及其意义

目的:构建高效表达人过氧化物酶体增殖物激活受体γ1(hPPARγ1)的真核表达载体,为hPPARγ1受体功能和基于hPPARγ1受体靶点的药物筛选提供分子研究平台。方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从HepG2细胞总RNA克隆hPPARγ1全长基因,与经XhoI、SmaI相同双酶切的pIRES2-EGFP载体连接,构建重组质粒phPPARγ1-IRES2-EGFP,经酶切及测序鉴定重组质粒中hPPARγ1基因的完整性和忠实性;荧光显微镜观察重组质粒转染的293细胞GFP报告基因表达强度,并对转染细胞hPPARγ1的表达进行荧光定量PCR及免疫细胞化学检测。结果:经酶切和测序证实重组质粒构建正确,并在转染的293细胞中获得hPPARγ1的高效表达。结论:成功构建phPPARγ1-IRES2-EGFP重组质粒,为基于hPPARγ1受体靶点的药物筛选平台的建立及受体功能研究提供了高效表达载体。

重组质粒phPPARδ-IRES2-EGFP高效体外转染表达体系的建立

目的:建立phPPARδ-IRES2-EGFP重组质粒高效体外转染表达的体系。方法:采用阳离子脂质体Lipofectamine2000将phPPARδ-IRES2-EGFP转染入293细胞,荧光显微镜观察质粒转染细胞GFP报告基因表达强度及转染效率,并对转染细胞hPPARδ的表达进行荧光定量PCR和Western Blot检测。结果:荧光显微镜下可见转染phPPARδ-IRES2-EGFP质粒的293细胞绿色荧光蛋白(GFP)报告基因高表达,转染效率高达(85±10)%;荧光定量PCR和Western Blot检测的结果表明,phPPARδ-IRES2-EGFP转染的293细胞其hPPARδ表达水平高于空载体转染对照组(P<0.01)。结论:成功建立phPPARδ-IRES2-EGFP质粒的高效体外转染表达体系,为hPPARδ受体功能的研究及基于hPPARδ为靶标的药物筛选平台的建立奠定了基础。