微小RNA在免疫调节中的作用研究进展

微小RNA(miRNA)是一类新发现的内源性非编码RNA分子,能在转录后水平调控基因的表达。研究证实,miRNA在细胞增殖、发育、分化、凋亡、代谢、信号转导以及肿瘤发生中发挥重要的调节作用。近年来,一系列的miRNA已被证实参与了免疫反应调控,如固有性免疫应答,T、B淋巴细胞的分化,病原体感染与免疫及炎症的免疫调控等。文中就miRNA在固有性与获得性免疫应答中的调控作用作一综述。

幽门螺杆菌微球疫苗非临床实验初步研究

目的:通过考察幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)微球生物学行为,探讨其作为口服蛋白疫苗的可行性。方法:用可降解天然高分子材料-壳聚糖和海藻酸钠制备Hp全菌蛋白微球(HpWCP-CAMS),通过BCA方法测定微球中蛋白质的包裹效率及包裹量,测定微球在体外的药物释放度。并进行小鼠体内微球的靶向试验,微球的体内外毒性试验和淋巴细胞致敏试验。结果:HpWCP-CAMS中蛋白包裹量为31.5%,蛋白包裹效率为61.0%。微球中药物缓释周期可长达20 d,靶向试验结果显示微球能在肠黏膜、PP结及脾脏富集并能有效诱导淋巴细胞致敏。体外毒性显示125μL微球(5 mg.mL-1)对Hela细胞生长无明显影响,体内实验结果显示其对小鼠生长也没有影响。结论:HpWCP-CAMS具有良好的靶向性和缓释特征,无细胞毒性,有望作为疫苗进一步研究。

致泻性大肠杆菌疫苗研究进展

大肠杆菌引起的腹泻多发生在儿童及发展中国家,发展致泻性大肠杆菌疫苗具有特殊的意义。除了灭活疫苗、减毒疫苗、结合多糖疫苗和亚单位疫苗外,新近出现的DNA疫苗、转基因植物疫苗和ghost疫苗技术为疫苗的研制提供了新的思路。本文综述了目前致泻性大肠杆菌疫苗研究的新进展。

microRNA在胃肠道肿瘤中的研究进展

microRNA(miRNA)是一段长度约22nt的内源性非编码单链RNA分子,能在转录后水平调控基因的表达。研究证实,miRNA在细胞增殖、发育、分化、凋亡、代谢、信号转导以及肿瘤发生中发挥重要的调节作用。近年来,miRNA已经被证实能够抑制癌基因或抑癌基因的表达,参与了胃肠道肿瘤的发生和发展。本文就miRNA在人胃肠道肿瘤中的作用作一综述。

百日咳杆菌毒素S1亚单位突变体的研究进展

百日咳杆菌毒素(PT)是目前无细胞百日咳疫苗中的主要保护性成分,其中PT的S1亚单位又是其主要的功能性亚基,具有免疫保护活性和多种毒性。在对多个S1突变体的生物学及免疫学研究后发现,其中的一个S1的双位点突变体(PTX-9K/129G)在保持有良好的免疫原性和免疫保护作用的基础上,大大降低了PT的毒性,有望成为理想的百日咳疫苗候补抗原。

新型免疫调节肽佐剂CEL-1000

CEL-1000是一种新型的免疫调节肽,它在抗疟疾、人类免疫缺陷病毒(H IV)、单纯疱疹病毒(HSV)感染和肿瘤疫苗的研制方面具有潜在的佐剂活性,能促进1型辅助性T淋巴细胞(Th1)型免疫应答。

抗幽门螺旋杆菌尿素酶B亚单位(UreB)单克隆抗体抗原识别表位的初步鉴定

目的初步确定抗幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)单克隆抗体(mAb)6E6识别的抗原表位。方法采用截短法分段构建含UreB抗原的重组质粒,分别命名为U12,U13,U15,U16,U47。用IPTG诱导表达融合蛋白。对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳及Westernblot分析。结果6E6能够分别识别1～300位氨基酸的U12片段,1～260位氨基酸的U16片段,1～230位氨基酸的U15片段,而不能识别1～200位氨基酸的U13片段和251～389位氨基酸的U47片段。结论mAb6E6抗体识别的抗原表位位于200～230位氨基酸。

人白细胞介素-24基因的克隆、表达和纯化

目的对人白细胞介素-24(hIL-24)进行克隆、表达和纯化。方法分离人外周血单个核细胞,ConA刺激培养,提取细胞总RNA,应用RT-PCR技术从外周血单个核细胞中扩增hIL-24成熟肽编码区,定向克隆至融合表达载体pGEX-4T-1,重组载体pGEX-4T-1/hIL-24经DNA测序鉴定后,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,阴离子交换层析纯化融合蛋白,SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果所得hIL-24基因经序列分析,与GenBank公布一致。所构建融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24测序正确,转化BL21(DE3)后,37℃诱导表达相对分子质量约为44000的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的30.63%。经纯化后,纯度达85%以上。Westernblot检测能与兔抗人IL-24的多克隆抗血清发生结合反应。结论已成功构建了hIL-24的融合表达载体pGEX-4T-1/hIL-24,并在大肠杆菌中高效表达,纯化后获得了高纯度的融合蛋白,为hIL-24的功能及活性研究奠定基础。

百日咳毒素S1亚单位突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的克隆百日咳毒素S1亚单位,获得其突变体(S1/9K-129G,rS1),构建原核表达系统,并鉴定融合蛋白的特异性。方法采用PCR和重叠延伸扩增得到突变体,将其与pMD18-T连接,转化至大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-T-rS1,经双酶切得到rS1活性结构域编码片段。将其插入pQE-30载体中,转化大肠杆菌M15株,经IPTG诱导表达。表达产物经镍离子柱纯化,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果PCR及重叠延伸获得了约700bp的目的基因片段,并获得阳性重组表达载体克隆,表达产物为相对分子质量27000左右的蛋白,Western blot检测能与兔抗百日咳毒素多价抗血清发生反应。结论成功表达并纯化了百日咳毒素S1亚单位突变体,为研制百日咳疫苗候补抗原的相关分子免疫学研究奠定了基础。

结核分枝杆菌H_(37)Rv株Rv0341编码基因iniB的克隆与表达

目的克隆并表达编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因。方法利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增iniB基因,克隆于pET-22b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性。结果克隆并表达了iniB基因,表达的蛋白相对分子质量约43000,诱导2h表达量较高,约为25%。目的蛋白主要以包涵体形式存在于超声沉淀中,纯化后蛋白纯度可达98%以上。经Western blot检测,纯化蛋白与依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)肺结核患者血清呈现强阳性反应,而与非依R菌肺结核患者血清不反应。结论已成功克隆并表达了编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因,表达的重组蛋白具有反应原性及特异性,为依R菌结核病临床血清学快速诊断方法的建立及试剂盒的研发奠定了基础。

结核分枝杆菌Rv0341蛋白编码基因iniB的多态性分析

目的研究结核分枝杆菌假设蛋白Rv0341编码基因iniB的多态性,确认其保守性,分析依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)在利福平(R)培养管中Rv0341高表达的可能原因。方法用大肠埃希菌做为阴性对照,提取依R菌(14株)、耐R菌(23株)、R敏感的结核分枝杆菌(12株)、结核分枝杆菌标准株H37Rv及BCG(共51株)的细菌基因组DNA,利用PCR自基因组DNA中扩增iniB基因,通过ApaⅠ/EcoRⅤ、KpnⅠ/SmaⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳检测其带型,对iniB基因进行限制性片段长度多态性分析并测序。结果实验组中iniB基因的酶切图谱完全相同,测序结果亦证实iniB基因无突变。结论 iniB基因在对R依赖、耐药和敏感等不同类型的结核分枝杆菌中是相对保守的;依R菌在Rv0341蛋白表达方面的差异可能是RNA转录差异或利福平诱导的结果。

靶向性抗肿瘤融合蛋白RGD-hIL-24的构建、表达和体外活性研究

目的构建靶向性抗肿瘤融合蛋白RGD-hIL-24,并对其体外抗肿瘤效应和肿瘤靶向性进行初步研究。方法利用PCR技术将GRGDS序列融合至hIL-24的N端,并将融合基因连接至表达载体pET-22b后,在大肠杆菌BL21(DE3)内进行表达。亲和层析法纯化RGD-hIL-24,复性后采用MTT比色法、荧光染色分析其体外抗肿瘤活性,并通过细胞黏附实验评价其肿瘤靶向性。结果获得RGD-hIL-24基因,序列分析正确。SDS-PAGE和Western blot证明融合基因在大肠杆菌表达相对分子质量(Mr)约为20×103的RGD-hIL-24,占全菌蛋白的26．47％,主要以包涵体形式存在。纯化后的蛋白纯度达90％以上。复性后的RGD-hIL-24能够诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,显著抑制其生长,并具有肿瘤靶向性。结论大肠杆菌成功表达RGD-hIL-24融合蛋白,体外实验证实RGD-hIL-24具有显著的抗肿瘤活性和肿瘤靶向性,为其在体内抗肿瘤效应和靶向性研究奠定了基础。

依赖利福平结核分枝杆菌Rv0341天然蛋白的诊断价值

目的探讨依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)Rv0341天然蛋白检测血清Rv0341抗体,诊断依R菌感染肺结核病的价值。方法典型依R菌经SDS-PAGE、转膜后,获得Rv0341天然蛋白带,采用结核分枝杆菌抗体DIGFA诊断试剂检测血清Rv0341抗体,并考察该方法的重复性、特异性及敏感性。结果利用Rv0341天然蛋白检测血清Rv0341抗体,具有良好的批内和批间重复性;血清Rv0341抗体在耐R菌肺结核组和R敏感菌肺结核组的特异性分别为92.3%(24/26)和79.3%(23/29),在依R菌肺结核R治疗组中的敏感性为88.9%(16/18);在培养阴性结核组中,阳性率为23.8%(29/122)。54份阳性结果血清进行重复实验,确认为阳性。结论Rv0341天然蛋白可作为诊断抗原用于依R菌结核病血清学诊断试剂盒的研发,以快速辅助诊断依R菌结核病,特别对菌阴依R菌结核病更有诊断价值。

鼠源性抗EHEC O157:H7 Stx2噬菌体Fab抗体库的构建及筛选

目的构建鼠源性抗EHEC O157∶H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,并从中筛选特异性的抗体。方法用EHEC O157∶H7 Stx2类毒素免疫BALB/c小鼠,取脾分离淋巴细胞,提取总RNA,RT-PCR分别扩增抗体轻、重链(к和Fd)基因,经双酶切依次克隆入噬粒载体pComb3X中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体M13K07进行超感染,构建抗EHEC O157∶H7 Stx2的Fab噬菌体抗体库。以纯化的Stx2为抗原进行筛选,获得抗EHECO157∶H7Stx2的特异性Fab抗体,Western blot法检测噬菌体抗体与毒素抗原的结合活性,并对所得阳性克隆进行基因序列分析。结果构建了一个库容为1.56×107的Fab抗体库,筛选出3株特异性较强的阳性克隆,其中2个可与Stx2A1亚单位抗原反应,1个可与Stx2B亚单位抗原反应。基因序列分析显示,轻、重链可变区氨基酸序列与GenBank中已注册的鼠免疫球蛋白可变区氨基酸序列同源性分别为98.5%和99.6%。结论已成功构建了鼠源性抗EHEC O157∶H7 Stx2噬菌体Fab抗体库,为进一步制备抗EHECO157∶H7Stx2的治疗性人源化抗体奠定了基础。