重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的纯化及生物学活性鉴定

目的 纯化rLTB并对其生物学功能进行初步研究。方法 重组基因工程菌发酵后 ,以包涵体形式表达的rLTB经过洗涤、变性溶解后 ,分别采用QSepharoseTM HighPerformance阴离子交换层析和PhenylFF(highsub)疏水层析对其进行纯化并透析复性 ,然后采用SDS PAGE和HPLC检测纯度 ,并选用ELISA、动物实验和Western blotting实验对纯化蛋白的生物学活性进行鉴定。结果 得到纯度达 97 85 %的rLTB ,复性的rLTB经检测具有良好的生物学活性。结论 得到纯度较高、生物学活性较好的rLTB 。

单链抗体及其在生物医学中的应用

单链抗体是一种小分子基因工程抗体,以其独有的优势在显像定位诊断、靶向治疗和基因治疗等方面展示了乐观的应用前景。本文对单链抗体的构建、表达及在生物医学中的应用作一综述。

肠出血性大肠杆菌O157：H7志贺毒素ⅡA1亚单位单克隆抗体的制备和生物学特性鉴定

目的制备出高效价的抗志贺毒素ⅡA1亚单位(STX2A1)的单克隆抗体。方法以重组GST-STX2A1融合蛋白作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,运用细胞杂交瘤技术制备,以天然STX2毒素为筛选抗原,采用间接ELISA法筛选产生针对STX2A1的单克隆抗体细胞株;以体内诱生法产生腹水,并采用Protein A-Sepharose柱对其纯化,快速定性试纸鉴定McAb的Ig亚类,采用间接ELISA相加实验鉴定抗原识别表位。结果获得3株产生针对STX2A1的单克隆抗体细胞株STX2-1A3、STX2-1E10、STX2-3A7,Ig亚类分别为IgG1λ型、IgG1κ型和IgG3κ,亲和力常数分别为5.76×109、1.21×109和3.97×108。结论成功制备3株稳定分泌抗STX2A1的杂交瘤细胞株,产生的单克隆抗体特异性好,亲和力高,能与天然STX2A亚单位反应。

重组人IL-10融合蛋白的表达及其生物学活性测定

目的在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素10融合蛋白,获得有生物学活性的IL10。方法限制性内切酶NcoⅠ和BamHⅠ双酶切目的基因IL10,插入到同样双酶切的表达载体pET32a,构建重组载体IL10pET32a,测序正确后转化E.coliBL21(DE3),不同温度、低浓度IPTG诱导工程菌表达目的蛋白,SDSPAGE和Westernblot检测目的蛋白的表达,ELISA和MC9细胞增殖法分别测定IL10的含量及生物学活性。结果构建的表达重组载体IL10pET32a经酶切鉴定和序列测定表明完全正确,诱导工程菌可以表达可溶性的融合蛋白IL10Trx,同时也存在包含体融合蛋白,经Westernblot鉴定存在有目的蛋白IL10,MC9细胞增殖法测定可溶性的融合蛋白具有生物学活性。结论成功表达了具有生物学活性的融合蛋白IL10Trx,有助于下游纯化和制备hIL10基因工程药物。

肠道黏膜免疫系统抗原提呈通路研究进展

抗原提呈是免疫应答过程中的核心环节,也是一个非常复杂的分子间相互作用的过程。本文以胃肠道黏膜存在的免疫细胞为基础,在细胞水平和分子水平阐述肠道黏膜免疫系统抗原提呈通路的研究新进展。

生物技术制药创新型实验教学平台的探索与实践

生物技术是生命科学和工程技术相互渗透、融合产生的一门新技术,是21世纪以来发展最为迅猛的高新技术之一,越来越广泛地应用于医药、农业、轻工、食品等诸多领域,对提升传统产业技术水平和可持续发展能力具有重要影响。随着生物技术的飞速发展。生物医药已成为全球最活跃、进展最快的产业之一。发展生物医药产业具有高效益、高增长、低污染、低耗能的好处，有很强的技术复合性和产业关联性。

幽门螺杆菌表位疫苗的设计、构建、表达及其免疫原性研究

目的设计幽门螺杆菌(Hp)的表位疫苗并对其免疫原性进行研究。方法将Hp的尿素酶B亚单位的三个Th表位及一个B细胞表位串联,表位之间用两个赖氨酸(KK)间隔,合成全基因,克隆到pET22b载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;表达的重组蛋白经鉴定纯化后皮下免疫Balbc小鼠,检测细胞免疫应答及体液免疫应答。结果克隆表达的重组表位疫苗蛋白纯化后纯度达到95%,经N端测序证实为设计的表位疫苗蛋白,Th表位多肽(U546-561、U229-244、U237-251)、表位疫苗蛋白及rUreB均能够刺激表位疫苗致敏的小鼠淋巴细胞增殖(SI>2),并且此疫苗能够刺激机体产生特异性抗体。结论本研究中表位疫苗的设计方法能够使疫苗中包含的四个表位均发挥功能,并且具有较强的免疫原性,为研究Hp预防性和治疗性疫苗提供实验基础。

Balb/c小鼠口服幽门螺杆菌疫苗rLTB-HspA的免疫应答

目的 研究幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A (rHspA)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)融合蛋白 (rLTB HspA)作为口服疫苗的免疫应答效果。方法 采用rLTB HspA口服免疫Balb c小鼠 ,ELISA分析小鼠血清、胃肠黏液中IgG、IgA抗体水平 ,体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况及IL 4、IFN γ的变化。结果 Balb c小鼠口服rLTB HspA能有效激发机体产生全身和局部特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答。结论 Balb crLTB

BalB/c小鼠口服重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫应答

目的 评价重组尿素酶B亚单位 (rUreB)作为幽门螺杆菌 (Hp)口服疫苗成份的效果、探讨Hp的免疫保护机制。方法 采用重组Hp保护性抗原UreB与粘膜免疫佐剂霍乱毒素B亚单位 (CTB)共口服免疫BalB/c小鼠 ,ELISA分析血清、唾液和粪便、胃粘液中IgG、IgA抗体水平 ,体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况及IL 4、IFN γ的变化。结果 BalB/c小鼠口服rUreB和CTB混合制剂能有效激发机体产生全身和局部特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答。

BALB/c小鼠口服重组幽门螺杆菌热休克蛋白A疫苗的免疫应答

目的 评价重组热休克蛋白A (rHspA)作为幽门螺杆菌 (Hp)口服疫苗成分的效果。方法 采用重组Hp保护性抗原HspA与粘膜免疫佐剂 (霍乱毒素 ,CT ;大肠不耐热肠毒素B亚单位 ,LTB)共口服免疫BALB c小鼠 ,ELISA分析小鼠血清、胃肠粘液中IgG、IgA抗体水平 ,体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况以及IL4、IFN γ的变化。结果 单纯口服rHspA组产生的抗体水平与对照组 (PBS)相差不显著 ,而rHspA +佐剂组与对照组相差非常显著。rHspA +佐剂组小鼠脾淋巴细胞体外培养 ,在Hp抗原刺激作用下出现明显的增殖反应 ;不加佐剂免疫组分泌IFN γ水平增加 ,IL 4水平未发现增加 ;而加佐剂免疫组除IFN γ水平增加外 ,IL 4水平也发现显著增加。结论 BALB

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位优势Th表位的系统筛选与鉴定

目的筛选幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B亚单位(UreB)中CD4+细胞优势应答表位,并确定其MHC限制性。方法以重组UreB蛋白(rUreB)与弗氏佐剂联合皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,从小鼠脾脏中体外扩增UreB特异性T淋巴细胞,采用步移重叠合成肽法筛选CD4+T细胞优势应答表位,分析其MHC分子限制性。结果 18mer短肽筛选发现UreB403-420和UreB409-426可显著刺激UreB特异性CD4+T细胞产生IFN-γ。13mer短肽鉴定实验结果显示,UreB409-421可刺激产生与18mer短肽UreB403-420和UreB409-426等同的应答强度。同时抗体阻断实验表明,抗H-2d(I-A)单克隆抗体能有效阻断该表位的应答。结论 UreB403-420和UreB409-426为UreB抗原中的优势Th表位,其刺激免疫反应的核心位置为UreB409-421,且存在H-2d(I-A)限制性。

幽门螺杆菌微球疫苗免疫诱导的免疫应答

目的通过对幽门螺杆菌微球免疫后Balbc小鼠血清IgG、IgA、胃肠sIgA的检测及脾脏IL4、IFNγ的mRNA表达水平、IgGASC、IgAASC数量的比较观察,探求疫苗的免疫保护机理。方法取Balbc小鼠口服免疫疫苗,剂量为150μg/(只·次),免疫时间为0、14、30d。2周后取血清及胃肠洗液进行抗体检测,同时取脾脏检测细胞因子mRNA表达水平及ELISPOT检测抗体分泌细胞数量变化。结果免疫后小鼠以上检测指标与对照组比较均有不同程度的升高。结论微球疫苗所诱发的免疫保护是细胞免疫、体液免疫两者共同作用的结果。

pT-ureB及pT-hpaA核酸疫苗诱导小鼠免疫应答的实验研究

目的观察并比较携带Hp不同抗原基因的质粒pTCAE-ureB(pT-ureB)和pTCAE-hpaA(pT-hpaA)肌注小鼠后诱导的体液免疫应答。方法构建真核表达质粒pT-ureB;与已成功构建的质粒pT-hpaA分别作为疫苗方案,肌肉注射免疫BALB/c小鼠并设置空质粒对照,末次免疫后第2、4、6周分别用间接ELISA法检测小鼠血清特异性IgG抗体滴度。结果两免疫组在末次免疫后第2周均可出现特异性IgG,抗体滴度随时间逐渐增高;末次免疫后第6周,两免疫组的抗体滴度与对照组相比较,差异极显著(P<0.01);且pT-ureB免疫组抗体滴度显著高于pT-hpaA(P<0.01)。结论pT-ureB具有良好的免疫原性,诱导体液免疫应答的能力优于pT-hpaA。

幽门螺杆菌UreB414-OMP18-LTB融合蛋白的构建及免疫原性初步研究

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylor,iHp)尿素酶B亚单位活性片段(UreB414)、外膜蛋白(OMP18)及大肠埃希菌LTB融合疫苗并研究其抗原性。方法PCR扩增ureb414、omp18、ltb基因,分别克隆入pMD18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UOL,然后将其亚克隆入原核表达载体pET-28 a,转化入大肠埃希菌BL21,SDS-PAGE电泳进行表达,W estern印迹检测表达蛋白的抗原性。结果PCR扩增分别获得约414、537 bp和320 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约1 200 bp目的基因。重组融合蛋白表达量可达细菌总蛋白的15%,免疫印迹检测结果显示该重组蛋白可为UreB、OMP18、LTB兔抗血清特异识别,具有良好的抗原性。结论成功构建了具有良好免疫原性的UreB-OMP18-LTB融合蛋白。

幽门螺杆菌感染对胃内正常菌群结构的影响

目的比较分析不同人群胃内菌群的特点,探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染对胃内菌群结构的影响,探讨胃内菌群与Hp相关疾病的关系。方法分别采集Hp阴性者、Hp正常携带者和Hp感染患者的胃黏膜标本220例,采用多种选择性培养基分别在需氧、微需氧、厌氧情况下分离培养细菌,结合Hp感染情况,分析胃内主要菌群的结构组成及定植数量。结果220例胃镜受检者中,Hp阴性82例,Hp阳性138例,Hp检出率为62.73%;乳杆菌检出率在Hp阴性者(59.76%)和Hp感染患者(27.84%)比较,差异有统计学意义(P<0.05),其余细菌在3类人群中检出率差异无统计学意义(P>0.05);细菌总量在Hp阴性者胃内的定植量显著高于Hp正常携带者和Hp感染患者(P<0.05);Hp阴性者中的乳杆菌、肠杆菌、链球菌所占比例分别为41.39%、16.90%、18.28%,检出数量和所占比例明显均高于Hp感染患者(P<0.05);厌氧菌在Hp感染患者的检出率最高,所占比例为43.77%,显著高于Hp阴性者(P<0.05)。结论Hp感染严重影响胃内菌群变化,胃内菌群(特别是乳杆菌与厌氧菌)与Hp致病性密切相关。

幽门螺杆菌沙鼠感染模型的定量分析研究

目的 建立幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)蒙古沙鼠感染模型 ,并通过比较定量培养、快速脲酶试验和ELISA三种方法 ,确定Hp动物模型的最佳评判指标。方法 采用临床分离的Hp强毒株对 2 0只蒙古沙鼠进行感染 ,4周后剖杀。取血按常规ELISA法检测抗Hp抗体 ;分别剪取胃窦、胃体和胃底粘膜组织作定量培养 ;其余组织作快速脲酶试验及病理检查。结果 经定量培养结果显示沙鼠的Hp感染率达到 80 % (16/ 2 0 ) ,胃窦、胃体和胃底的Hp定植密度的对数均值分别为 5 2 4± 1 5 0、4 11± 3 2 2、和0 97± 2 3 9;16只Hp阳性沙鼠中脲酶试验有 4只阳性 ,ELISA有 7只阳性 ,阳性鼠的感染均值显著高于阴性鼠。结论 经筛选的Hp强毒株成功感染沙鼠后 4周 ,Hp主要定植于胃窦和胃体部 ;

抑制FoxO1基因表达的siRNA重组腺病毒载体的构建及功能鉴定

目的构建针对转录因子FoxO1的siRNA腺病毒载体,并鉴定重组腺病毒在人肝癌细胞系HepG2中对内源性FoxO1基因表达的影响。方法设计并合成针对FoxO1的siRNA的靶DNA序列,克隆于穿梭载体pAdTrack-CMV中,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染293细胞,包装得到含si-FoxO1的重组腺病毒,体外转染人肝癌细胞系HepG2,Westernblot检测FoxO1蛋白表达水平的变化。结果成功构建针对FoxO1的siRNA重组腺病毒载体,该重组腺病毒能显著抑制HepG2细胞中FoxO1蛋白的表达(P<0.01)。结论成功构建了针对FoxO1的siRNA重组腺病毒载体,能有效抑制HepG2细胞中FoxO1的表达。

HP0318基因在幽门螺杆菌适应性定植中的作用研究

目的通过构建幽门螺杆菌(Hp)HP0318缺失突变株,初步探明该基因在Hp适应性定植中的作用。方法通过基因克隆和重组技术在HP0318基因上下游片段之间连入氯霉素抗性基因(catGC)作为筛选标记,并克隆到质粒pBluescript SK中构建成缺失突变的打靶载体,将其转化沙鼠适应株M13,经过同源重组,对出发菌的HP0318基因进行置换突变,然后用经氯霉素抗性筛选的突变菌株感染蒙古沙鼠,观察其与未突变的M13出发菌在定植能力和致病性上的差异。结果经PCR鉴定成功构建1株缺失HP0318基因的Hp菌株。突变株与非突变株对蒙古沙鼠的感染率相差显著(P<0.05),2个菌株在胃内的定植密度有显著性差异(P<0.05),突变株定植密度有约5倍的减少。结论HP0318基因在Hp的沙鼠适应性定植过程中发挥了重要的作用。

外源性Wnt5a激活K562细胞非经典Wnt5a／Ca^2＋信号途径研究

目的观察外源性Wat5a对K562细胞非经典Wnt5a/Ca2+途径的影响,进一步研究外源性Wnt5a诱导K562细胞的分化机制。方法激光共聚焦显微镜观察Ca2+内流的变化,以RT-PCR及免疫组化检测β-catenin的表达变化,以Western blot检测cyclinD1的表达变化。结果外源性Wnt5a能明显促进K562细胞Ca2+内流,显著下调cyclinD1表达,且能下调K562细胞β-catenin表达,但β-catenin表达下调无统计学意义。结论外源性Wnt5a能激活K562细胞非经典Wnt5a/Ca2+途径,外源性Wnt5a诱导K562细胞分化机制可能与此相关。