重庆市免疫学会第二届学术年会在第三军医大学召开

2013年12月7～8日，重庆市免疫学会第二届学术年会在第三军医大学第二教学馆顺利召开。本次会议南重庆市免疫学会主办、第三军医大学全军免疫学研究所承办，全市免疫学领域共计200余人参会。

以小鼠精子/睾丸特异性抗原为基础的合成肽免疫避孕效应研究

目的 研制以精子 睾丸特异性抗原为基础的多价嵌合肽避孕疫苗。方法 选择小鼠精子 睾丸特异性抗原Sp17、Cy ritestin作为对象 ,采用分子设计的方法与外源性牛核糖核酸酶非选择性T细胞表位组合合成新型嵌合肽 3 5肽 ,并对其免疫效应进行研究。结果 该嵌合肽可刺激小鼠产生较高效价的血清和阴道粘膜特异性抗体 ,诱导脾脏淋巴细胞增殖 ,促进细胞因子IL 4的分泌 ;将其与佛氏佐剂混悬 ,免疫雌性BALB c小鼠可明显降低受孕率和每胎产仔率 ,其抗血清可显著抑制体外精 卵结合和融合。结论 新型嵌合肽具有较明确的抗生育作用 ,提示以分子设计、蛋白质优化方案进行多价避孕疫苗的研究是可行的。

HBV新型免疫原的设计、合成及免疫原性研究

目的 探讨如何将表位构建成有效免疫原。方法 以Pre S( 2 ) 蛋白两优势性B细胞表位和HBcAg两Th细胞表位为基础 ,设计、合成了 2种MAP多肽 ,以此两MAP肽为免疫原免疫兔和小鼠 ,观察体液免疫反应。结果 此两种MAP多肽均比Pre S( 2 ) 蛋白诱发更高抗体滴度 ;Th细胞表位引入可显著增强反应强度。结论 增加肽抗原结构复杂性可提高其免疫原性 ,其表位排列以B细胞表位在赖氨酸核心外侧为佳 。

基于HBV核心抗原CTL表位的治疗性多肽在体诱导抗原特异性细胞免疫应答的研究

目的 探讨基于表位的治疗性多肽抗原组分、结构与诱导免疫应答之间的关系。方法 用分子设计的理论和方法 ,设计基于HBV抗原免疫优势性CTL、Th及B细胞表位的 3种治疗性多肽候选疫苗分子 ,经Merrifield固相多肽合成技术合成 ,并经HPLC纯化、鉴定。以BALB c(H 2 d)纯系小鼠为实验对象 ,进行体内免疫学功能研究。结果 所设计治疗性多肽分子可在体诱导较强的抗原特异性CTL应答和适度的抗体反应。Th、B细胞表位的引入可增强CTL表位肽的效应。结论 提示在治疗性表位多肽疫苗的分子设计中 ,引入B -、Th表位可显著提高CTL表位肽的免疫原性。

穿膜肽HIV-Tat_(49-57)和CTL表位融合多肽疫苗的初步免疫学效应研究

目的 探讨穿膜肽HIV Tat4 9- 57将CTL表位带入活细胞胞质并将其投入MHC Ⅰ类抗原提呈途径的可能性。方法 应用多肽固相合成技术 ,分别合成含HIVTat4 9- 57和HLA A2 1限制性CTL优势表位MART 12 7- 35的 18肽和该CTL表位 9肽。采用间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜技术 ,分别对上述 18肽和 9肽的穿膜能力进行了动态观察。进一步用标准51 Gr释放试验分别检测了上述 18肽和 9肽在HLA A2 1阳性健康者外周血单个核细胞 (PBMC)中诱导的表位MART 12 7- 35特异性CTL活性。结果 18肽能够穿过活哺乳动物细胞质膜进入胞质 ,并呈现出时间、剂量依赖关系 ;而 9肽则无此效应。与 9肽相比 ,18肽在体外诱导出了明显增强的特异性CTL活性 (P <0 0 5 )。结论 穿膜肽HIVTat4 9- 57可有效携带CTL表位穿过细胞膜进入胞质 ,并有效激发出针对该表位的特异性CTL应答 。

肿瘤抗原MAGE-2多抗原肽疫苗的设计合成及免疫原性研究

目的 采用多抗原肽 (multipleantigenpeptide ,MAP)设计方案 ,提高线性短肽的免疫原性。方法 对肿瘤抗原MAGE 2 2 2 0 2 2 8细胞毒性T细胞 (cytotoxicTlymphocyte ,CTL)表位进行分子修饰 ,设计、合成四分支多抗原肽 (MAP4)。标准Fmoc合成方案进行合成 ,液相色谱 质谱联用 (LC MS)进行目的肽鉴定。以体外刺激人外周血单核细胞 (PBMC)诱导CTL效应及IFN γ分泌 ,标准 51 Cr释放实验与Elispot实验进行免疫原性的研究。结果 标经准 51 Cr释放实验验证 ,低浓度的MAP4可以诱导出有效的CTL效应 ,Elispot实验显示MAP4能够有效诱导的IFN γ分泌。结论 MAP的构建能够增强CTL效应和IFN γ的分泌 。

小鼠精子蛋白Sp17的克隆、表达及其免疫原性研究

目的获得鼠精子蛋白Sp17基因,构建重组表达载体并实现其在大肠杆菌中的高效表达,为制备免疫性避孕疫苗奠定基础。方法提取BALB/c小鼠睾丸组织总RNA,通过RT-PCR扩增Sp17基因全长cDNA序列,并将其克隆至pMD 18-T质粒载体中,再经HindⅢ/XhoⅠ双酶切将Sp17基因片段亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot对表达产物进行初步鉴定,并检测重组蛋白Sp17免疫小鼠后血清特异抗体滴度。结果获得了小鼠Sp17的全长cDNA,成功构建了重组原核表达载体pET/Sp17,在IPTG的诱导下实现了目的蛋白在大肠杆菌中的高效表达,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体。结论小鼠精子蛋白Sp17基因序列已被克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效、正确的表达,重组蛋白Sp17能够诱导产生特异性免疫反应,具有一定程度的免疫原性。

O-糖基化HBVPre-S_(2)CTL表位分子模建及免疫学活性研究

目的 研究O 糖基化 (Glycosylation)修饰对HBVPre S( 2 ) 上CTL表位结构及其免疫学活性的影响。方法 选择HBVPre S( 2 ) 上公认的HLA A2限制性CTL表位 44～ 5 3(SILSKTGDPV) ,以Ser44为糖基化位点 ,进行计算机分子模建 ,并利用糖肽合成技术 ,固相合成α GalNAc糖基化CTL表位 ,免疫BALB/c(H 2Db)小鼠 ,观察其诱导CTL活性。结果 α GalNAc 糖基化可改变表位形态使之更适宜与HLA A2类分子结合 ,糖基部分基团可从HLA A2结合沟中向外伸出。与对照组比Ser44α D GalNAcO 糖基化 44～ 5 3肽 ,诱导出较强的针对经抗原预刺激P815细胞的CTL应答 ,特别是 5 0 μg和 5 0 0 μg组 ,而且有明显的剂量 效应关系。 结论 Ser44α D GalNAc 糖基化修饰能改变Pre S( 2 ) 上CTL表位 44～ 5 3的结构 ,并促进特异性CTL应答 。

《医学免疫学》本科生教学的几点体会

医学免疫学是医学院校本科教育开设的一门重要基础课.由于免疫学的一些概念和理论非常抽象,新理论和新技术进展迅速,它成为医学生难学的课程之一.如何使其内容由难变易、由抽象变具体、由深奥变浅显,这是授课教师在教学上值得探讨的问题.几年来,我们在免疫学教学中,注重加强教学改……

含CpG寡聚脱氧核苷酸对肿瘤抗原肽P815AB的免疫佐剂效应研究

目的 以肿瘤抗原P815AB抗原肽为模式抗原 ,研究CpG寡聚脱氧核苷酸 (CpGODN)对该肿瘤抗原表位肽的免疫佐剂效应。方法 用 [3H ] TdR掺入法研究CpGODN体外刺激小鼠脾细胞增殖效应 ,用ELISPOT和 [3H] TdR释放法检测不同构成形式的疫苗在体诱发特异性CTL应答的效应。结果 ODN182 6在体外可刺激小鼠脾细胞显著增殖。经 4次免疫 ,在“肽 +ODN182 6 +IFA”组中 ,4/6的小鼠体内出现了特异性CTL应答 ;在“肽 +ODN182 6 +PBS”组 ,有 3只小鼠在完成 4次免疫前先后死亡 ,余 3只中有 1只体内也可检测到相应CTL反应 ;而对照“肽 +IFA”组 ,6只小鼠体内均未诱发出特异性CTL应答。结论 CpGODN对P815AB表位肽有较为理想的免疫佐剂效应 ,但疫苗构成形式对其免疫效果有着决定性的作用 ,“肽 +ODN182 6 +IFA”是本研究中最有效的疫苗形式 。

小鼠肥大细胞瘤基因疫苗的免疫治疗作用研究

目的 探讨α 病毒RNA复制酶对基因疫苗的免疫学效应的加强作用 ,寻找更好的基因疫苗形式。方法 将小鼠肥大细胞瘤P815的肿瘤特异抗原P1A基因克隆到含SFV的RNA复制酶的真核表达载体pSMART2a中 ,以此作为肿瘤基因疫苗 ,观察该疫苗对P815种植瘤的防治作用、特异细胞毒T淋巴细胞激活和抗体的生成情况。结果 该重组基因疫苗在体外有很好的表达 ,注射后CTL的最大杀伤效率为 60 % ,而普通载体疫苗形式pCI neo P1A则只有 40 %的杀伤活性 ;在观察期限内 ,前者的动物成瘤率和动物生存率分别为 2 0 %和 40 % ,后者则分别为 60 %和 2 0 %。两种情况下都不能检测到任何特异抗体的产生。结论 α 病毒RNA复制酶对基因疫苗的免疫学效应有加强作用。

胃癌、食管癌中NY-ESO-1抗原特异性免疫应答与生存率的关系研究

目的分析胃癌、食管癌中NY-ESO-1抗原基因的表达分布、NY-ESO-1157-165表位引发的特异性细胞免疫应答的状态与生存率的关系。方法利用RT-PCR方法检测112例胃癌和76例食管癌患者肿瘤标本和正常胃黏膜中NY-ESO-1抗原基因的表达,应用多色流式分析结合HLA-A2限制性表位肽/五聚体复合物技术对胃癌、食管癌患者外周血NY-ESO-1157-165表位特异性CTL进行精确定量。回顾分析20例NY-ESO-1+/HLA-A2+患者,随访3年,比较不同免疫应答状态对生存率的影响。结果食管癌患者中NY-ESO-1mRNA表达频率(36.8%)明显高于胃癌(13.4%)。在20例检测到的NY-ESO-1+HLA-A2+患者中,强反应者(CD8+pentamer+cells≥0.5%)生存率明显高于弱反应者(CD8+pentamer+cells<0.5%)(P<0.01)。结论胃癌、食管癌患者均有不同程度表达NY-ESO-1,其特异性免疫应答被检测到,并与生存率有关。

Flk-1265-2493与C3d3基因融合质粒诱导小鼠免疫应答的初步研究

目的对pSG.SS.Flk-1265-2493.C3d3.YL及pSG.SS.Flk-1265-2493.YL真核表达质粒的免疫效应进行初步研究。方法构建pSG.SS.Flk-1265-2493.C3d3.YL及pSG.SS.Flk-1265-2493.YL真核表达质粒后,48只BALB/c小鼠随机均分为疫苗组、疫苗对照组、质粒对照组、空白对照组(12只/组),分别肌肉注射接种此2种质粒、pSG.SS.YL质粒和PBS。免疫后动物:①每组6只取脾脏分离细胞,MTT法测定经Flk-1蛋白刺激后的增殖效应,乳酸脱氢酶释放法测定对培养小鼠肺微血管内皮细胞的杀伤作用;②其余6只动物于不同时间点断尾取血分离血清,ELISA法测定抗Flk-1抗体水平的动态变化。结果经Flk-1蛋白刺激,疫苗组小鼠脾淋巴细胞的增殖效应明显较强,刺激指数显著高于其他3组(P均<0.01),对靶细胞(MVECs)的杀伤活性在不同效/靶比时均显著高于其他3组(P均<0.01)。疫苗组动物血清抗Flk-1抗体比对照疫苗组抗体阳性反应出现早2周,二者峰值效价均出现在5周(血清稀释度:1∶3840vs1∶60),前者12周时仍保持较高水平(1∶960),后者10周时抗体阳性反应已消失。结论C3d3的连接有效增强了Flk-1265-2493的免疫原性。

超抗原SEB的免疫抑制作用及其机制的初步研究

目的研究金黄色葡萄球菌肠毒素SEB作为超抗原的免疫抑制性作用及其可能机制。方法BALB/c小鼠注射金黄色葡萄球菌B型肠毒素(staphylococcal enterotoxin B,SEB),分离其脾脏细胞,研究SEB刺激小鼠脾细胞产生的反应,并通过FCM检测脾细胞表面CD4和CD25分子的表达情况,探讨其内在机制。结果FCM表明与生理盐水对照组相比,注射过SEB后的BALB/c小鼠的脾脏细胞中CD4和CD25双阳性细胞比例增加,提示SEB的免疫抑制作用可能和其诱导调节性T细胞有关。结论SEB可以在小鼠体内有效诱发具有抑制活性的调节性细胞,这可能是SEB在动物体内诱发免疫低反应的机制之一。

小鼠骨髓间充质干细胞的分离与纯化培养的实验研究

目的探索小鼠骨髓间充质干细胞的体外纯化培养方法。方法先采用直接贴壁法培养的小鼠股、胫骨髓细胞,再用免疫磁珠法分选第3代中的CD11b-细胞。取分选纯化细胞进行形态学观察,并检测细胞在不同诱导条件下向成骨细胞及脂肪细胞的分化能力。结果①原代及传代培养的小鼠骨髓贴壁细胞多呈梭形,部分呈不规则型,其中含有较多的CD11b+细胞;磁珠分离后的纯化细胞呈现纺锤型、星型及不规则型等多种形态,细胞质丰富,核仁明显,细胞平行排列或漩涡状生长;②成骨诱导3周后mMSCs分化为成骨细胞,茜素红S染色有橘红色磷酸盐胞外基质沉积;③随着成脂化诱导时间的延长,细胞逐渐增大,油红O染色可见胞质内大量橙红色脂肪空泡。结论单纯的贴壁及传代培养不能纯化小鼠骨髓间充质干细胞,贴壁与免疫磁珠分离相结合才是一种有效的mMSCs体外分离和纯化方法。

多表位组合肽诱导HLA-A2^+人PBMC产生抗原特异性CD8^+T细胞应答的研究

目的 探讨基于HBV抗原优势表位的治疗性多肽抗原组分、结构与体外诱导CD8+ T细胞应答之间的关系。方法 用计算机辅助分子设计技术 ,设计基于HBV抗原免疫优势性CTL表位、B细胞表位和破伤风类毒素通用Th细胞表位的 3种治疗性多肽候选疫苗分子 ,经Merrifield固相多肽合成技术合成 ,并经HPLC纯化、鉴定。以HLA A2 + 健康人和慢性乙型肝炎患者的PBMC为实验对象 ,进行体外诱导CD8+ T细胞应答的免疫学功能研究。结果 所设计治疗性多肽分子可在体外诱导较强的抗原特异性CD8+ CTL应答 ;“ AAA ”铰链区设计和“Th +B”细胞表位的引入可增强CTL表位肽的免疫原性。结论 提示在治疗性表位多肽疫苗的分子设计中 ,短而高柔性的“铰链区”设计和“Th +B”

慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTLs的KIR表达研究

目的检测慢性乙型肝炎患者外周血中HBV特异性CTL细胞表面杀伤细胞抑制性受体(KIR)的表达情况。方法利用MHC-Ⅰ-肽-五聚体(pentamer)技术结合流式三色分析技术,直接离体情况下检测(directex vivo)慢性乙型肝炎患者不同HBV特异性CTL细胞表面KIR的表达情况。结果在慢性乙型肝炎患者,KIR阳性的CD8+T细胞明显增加;KIR阳性的HBcAg(18-27)特异性CTL、HBeAg(335-343)特异性CTL、HBp(575-583)特异性CTL的百分比分别为12%、20%、35%。结论慢性乙型肝炎患者不同HBV特异性CTL表达KIR,这可能与慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTL功能低下密切相关。

农杆菌介导鼠源轮状病毒vp4基因转化马铃薯条件优化研究

目的 获得马铃薯再生和农杆菌介导的遗传转化体系。方法 以马铃薯品种“台湾红”为受体材料 ,对其再生和农杆菌介导的遗传转化体系进行了研究。结果 诱愈培养基为MS + 0 1mg L 2 ,4-D + 1mg LBA ,出芽培养基为MS + 1mg LZT +5 0mg LGA3 ,卡那霉素浓度为 5 0mg L ,农杆菌液浓度为A6 0 0 =0 5。通过该体系将一鼠源轮状病毒外壳蛋白基因vp4导入马铃薯中 ,获得了具卡那霉素抗性的转化植株。经PCR验证 ,外源基因已导入马铃薯基因组中。结论 获得相对高效的马铃薯遗传转化体系 ,并成功地将外源基因转入马铃薯中。

乙肝治疗性多肽免疫刺激复合物的制备及鉴定

目的 为有效提高小分子多肽在体诱导CTL应答的能力 ,制备了乙肝治疗性多肽免疫刺激复合物 (ISCOMs) ,并对其形成进行了鉴定。方法 乙肝治疗性多肽ISCOMs采用透析法制备获得 ,并经小分子多肽的SDS PAGE电泳法确定了复合物中小分子多肽的存在 ,采用Bradfords法测定了复合物中多肽的结合量。结果 在电镜下呈典型的蜂巢状亚微型颗粒结构 ,所制备的ISCOMs中多肽的结合量约为 0 .30mg/ml。结论 ISCOMs的成功制备 。