辐照猪皮与重组人表皮生长因子凝胶治疗小面积Ⅱ度烧伤的临床观察

目的观察辐照猪皮与重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor,rhEGF)凝胶用于治疗Ⅱ度烧伤的临床疗效。方法选择135例Ⅱ度烧伤患者,分成3组,分别是辐照猪皮组、rhEGF凝胶组和对照组(碘伏油纱组),观察创面愈合时间、患者疼痛度、换药工作量、色素沉着度、愈合后效果以及1年后随访效果。结果不同治疗方式的愈合时间:对照组>rhEGF凝胶组>辐照猪皮组。辐照猪皮组和rhEGF凝胶组对Ⅱ度烧伤创面的治疗效果均优于对照组,平均愈合时间提前3～5 d,差异有统计学意义(P<0.01),且辐照猪皮组效果要略优于rhEGF凝胶组(P<0.05);rhEGF凝胶组和辐照猪皮组的患者疼痛度减轻及换药工作量相对对照组明显减少(P<0.01),且患者创面愈合效果良好、较少引起色素沉着,1年后部分患者随访证实远期愈合效果好,较少引起瘢痕增生。结论辐照猪皮和rhEGF治疗Ⅱ度烧伤效果确切、预后良好,临床上值得广泛使用。

早期类风湿关节炎患者肠道微生物群落的分析

目的研究类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者肠道微生物群落分布特点,探讨类风湿关节炎与肠道菌群的关系。方法收集30例早期RA患者(RA组)与21例健康受试者(对照组)粪便样本,培养与测定肠道菌群计数水平;提取粪便样本基因组DNA,PCR扩增细菌V6-V8区16SrDNA,产物经变性梯度凝胶电泳分离,获得肠道菌群DGGE图谱,分析肠道细菌丰富度、Shannon-Wiener指数、均匀度指标,用非加权类平均法对图像进行相似性聚类分析,并绘出聚类树形图,研究RA患者肠道菌群结构与健康受试者的差异。结果双歧杆菌含量:RA组为(6.21±1.48)CFU/ml,显著低于对照组(8.55±0.90)CFU/ml(P<0.01),脆弱类杆菌的含量:RA组为(6.54±1.28)CFU/ml,显著低于对照组(8.73±0.90)CFU/ml(P<0.01),乳杆菌、梭菌、肠杆菌、肠球菌数量差异无统计学意义(P>0.05)。肠道菌群DGGE图谱示:与对照组[丰富度:(22.8±3.12);Shannon-Wiener指数:(2.98±0.26);均匀度:(0.96±0.05)]相比,RA组丰富度[(16.0±1.05),P<0.01]、Shannon-Wiener指数[(2.48±0.14),P<0.01]和均匀度[(0.90±0.05),P<0.01]显著降低,分别表明RA患者肠道细菌的种类(丰富度)、菌群结构复杂程度、细菌的相对密度(均匀度)显著降低,在DGGE图谱下方区域RA患者肠道菌群条带数量减少,消失明显。图谱相似性聚类分析显示:20例样本聚为两类,一类样本中包含10例患者与1例健康人,二类样本中包含9例健康人。表明RA患者肠道菌群有较高的相似性,RA与健康人肠道菌群相似性低。结论早期RA患者肠道存在菌群失调,肠道细菌数量及结构与健康人有显著差异,其差异变化可能是类风湿关节炎的发病因素之一。

2种腺相关病毒介导的增强型绿色荧光蛋白对人成纤维细胞转染效率的研究

目的比较2种不同腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的增强型绿色荧光蛋白对人皮肤成纤维细胞(human fibroblast,HFB)的转染效率。方法原代分离培养人皮肤成纤维细胞并鉴定,按照感染复数(multiple of in-fection,MOI)为104、105、106转染传2代的人成纤维细胞,流式细胞检测AAV2-EGFP和AAV2/1-EGFP对HFB的转染效率,倒置荧光显微镜观察转染后的荧光强度。MTT法检测AAV2-EGFP和AAV2/1-EGFP对HFB的毒性。结果腺相关病毒AAV2-EGFP对HFB的转染效率随着MOI增加而增高,MOI为104时转染效率为(7.68±1.18)%,当MOI达到105后,转染效率稳定在(22.16±5.59)%,随着MOI增加,最高至MOI 106转染效率无显著提高。而病毒AAV2/1对于HFB的转染效率在MOI为106转染效率仅为(3.47±0.93)%。2种病毒在转染过程中,细胞生长正常,MTT显示各转染组与未转染组的吸光度值无统计学差异。结论AAV2载体对体外培养的HFB转染效率高于AAV2/1,但2种病毒载体对人皮肤成纤维细胞转染效率均不高,AAV2/1-EGFP对HFB几乎无感染能力。

胎猪皮肤前体组织异种移植模型的研究

目的探讨胎猪皮肤前体组织异种移植模型及移植后发育过程。方法取精确胎龄为56d的胎猪皮肤前体组织,分组进行移植,①背部创面模型组:制备成微粒皮后移植到BALB/c裸鼠背部创面,以人尸体皮覆盖;背部皮下模型组:制备成小张邮票皮,植入裸鼠背部皮下;耳廓皮下模型组:制备成微粒皮植入裸鼠耳廓皮下。各组于移植后观察其生长发育特性,并于移植后6周和12周取材行HE染色观察其组织结构形态。新生组织块大小采用双样本t检验。结果各模型的胎猪皮肤前体组织移植后均能存活并继续生长,背部创面模型组生长能力显著大于耳廓皮下模型组,新生皮肤组织均具有真皮和表皮,耳廓皮下模型的真皮附属器仅见毛囊(毛发),偶见皮脂腺,未见汗腺,但是背部创面模型组及背部皮下模型组不仅能发育成毛囊(毛发)、还见大量皮脂腺和汗腺。结论背部创面移植模型最适合于胎猪皮肤前体组织异种移植及移植后发育的研究。

乳杆菌细胞壁表面黏附相关蛋白的提取和鉴定

目的:提取和鉴定参与乳杆菌黏附肠上皮样细胞以及粘蛋白受体的细胞壁表面蛋白. 方法:采用HRP标记的粘蛋白受体以及NHS—Biotin标记的HT-29细胞与提取的乳杆菌JCM1081的细胞壁表面蛋白进行蛋白印迹,对参与黏附的细胞壁表面蛋白进行初步鉴定. 结果:Western blot结果显示Mr29 000和Mr 14 000的两种细胞壁表面蛋白在与粘蛋白受体和HT-29细胞的杂交中都出现了强阳性. 结论:存在于乳杆菌JCM1081细胞壁表面的Mr29 000和Mr 14 000的两种蛋白能够特异性识别粘蛋白受体和细胞膜受体,并与之结合,为乳杆菌JCM1081的黏附相关蛋白.

乳杆菌粘附机制的研究进展

乳杆菌是肠道内的生理性有益菌,乳杆菌粘附定植于肠黏膜上皮是其发挥生理作用的前提和基础,乳杆菌细胞壁表面的脂磷壁酸、S层蛋白、胞壁表面蛋白以及细胞壁多糖均参与了其与肠上皮细胞膜受体的结合。

CYP3A22稳定表达HepG_2细胞株的建立及其探针药物代谢活性鉴定

目的建立稳定表达Bama小型猪细胞色素CYP3A22的HepG2细胞株。方法通过从Bama小型猪肝组织中提取tRNA、经RT-PCR得到Bama小型猪CYP3A22的基因,并将此基因克隆至亚克隆载体pMD18-T上得到重组质粒pMD-3A22;以测序确定的重组质粒pMD-3A22为模板,采用PCR扩增CYP3A22基因并在其3′添加组氨酸标签,扩增产物经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切,将带有组氨酸标签的CYP3A22基因定向克隆至pcDNA3.1(+)中,测序表明,CYP3A22基因真核表达载体正确构建;将测序正确的CYP3A22基因通过脂质体转染至HepG2细胞,G418筛选10代,RT-PCR及Western blot分析,并用探针药物硝苯地平对重组细胞进行进行活性鉴定。结果与HepG2相比,HepG2-CYP3A22细胞株具有极显著的硝苯地平氧化活性。结论成功建立了稳定表达CYP3A22的HepG2细胞株,可用于相关的药物代谢研究。

慢病毒介导HLA-G转基因小鼠的建立

目的以慢病毒作为载体建立HLA-G转基因小鼠,为研究HLA-G与移植免疫提供模型动物。方法利用FUW载体,构建含有HLA-G编码序列的慢病毒表达载体FUW-HLA-G。用磷酸钙沉淀法将包装质粒psPAX2、PMD2.G与重组慢病毒载体质粒FUW-HLA-G共转染293FT细胞,包装成慢病毒。通过同步转染含有绿色荧光标记基因的慢病毒质粒FUGW为参照,测定FUW-HLA-G病毒液的滴度。用显微注射法将浓缩后的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下,建立HLA-G转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因整合,用RT-PCR检测转基因在转录水平的表达,用Western blot检测HLA-G蛋白的表达。结果载体BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切结果和测序结果显示重组的慢病毒质粒与所设计的序列一致。浓缩和纯化后的病毒液滴度达到109TU/ml以上,符合用慢病毒制备转基因小鼠的要求。PCR筛选出阳性鼠6只,RT-PCR与Western blot检测结果表明HLA-G基因在F0和F1代转基因小鼠中均有表达。结论通过慢病毒介导的基因转移,成功建立了表达人HLA-G蛋白的转基因小鼠,为研究HLA-G的功能及其在器官或组织移植中的效应提供了动物模型。

残留剂量恩诺沙星对SPF小鼠肠道微生态的影响

目的通过分析残留剂量恩诺沙星对SPF级小鼠肠道菌群耐药性、定植抗力的影响,评估现行恩诺沙星ADI值的微生物安全性。方法采用SPF级KM小鼠,通过饮水连续给药恩诺沙星35 d,给药剂量分别为0、0.005、0.05、0.55、mg/kg d。实验内容由两个独立的平行实验构成,实验一观察菌群耐药率的变化;实验二在给药恩诺沙星10 d后,灌胃接种白假丝酵母菌,观察小鼠肠道内白假丝酵母菌的清除情况。结果0.55、mg/kg d剂量组的总需氧菌及总厌氧菌的耐药率明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)。0.55、mg/kg d剂量的恩诺沙星可降低小鼠肠道菌群对外源性白假丝酵母菌的清除力。结论未观察到0.05 mg/kg d恩诺沙星剂量(对应于现行ADI值)对小鼠肠道菌群的影响,当剂量大于0.05 mg/kg d时,可能对小鼠肠道微生态造成负面影响,说明我国现行恩诺沙星ADI值安全性较好,不会对人体肠道菌群造成负面影响。

C_(57)BL/6J小鼠主要器官的组织学数据库的建立

目的建立C57BL/6J小鼠主要器官的组织学数据库。方法选取C57BL/6J小鼠雌性10只,雄性10只,将其麻醉致死,解剖切取心、肝、脾、肺、肾、胃等45个器官和组织,用10%的中性缓冲福尔马林固定,石蜡切片,常规HE染色,用显微镜观察,图像采集,用计算机对图像进行标注。采用SQLSEVER2000数据库管理系统,C#编程语言,B/S(浏览器/服务器)为系统构架。结果解剖20只C57BL/6J小鼠主要器官和组织,制做了1 589张切片,观察采集了13 578张图片,对1 563张图片进行了标注,建立了容量达7.85 GB的C57BL/6J小鼠主要器官的组织学数据库。结论构建可查询的C57BL/6J小鼠主要器官的形态学数据库,是研究疾病模型小鼠方便快捷的对照图库。

不同转移特性人肺癌裸鼠移植瘤整合蛋白表达及其对移植瘤转移的影响

目的：观察人肺癌裸鼠移植瘤整合蛋白表达与其转移的相关性。方法：以ＡＢＣ免疫组化染色，对转移力由低到高依次为ＰＬＡ－８０１Ｃ、Ａｎｉｐ９７３、ＰＬＡ－８０１Ｄ、ＰＬＡ－８０１ＤＬ四株人肺癌裸鼠移植瘤作整合蛋白亚单位表达的观察，并在裸鼠体内观察整合蛋白β１抗体及其配体ＲＧＤ多肽对移植瘤生长及转移的影响。结果：四株移植瘤均呈α２、α５、α６Ｂ阴性。β１的表达除Ａｎｉｐ９７３呈强阳性、ＰＬＡ－８０１ＤＬ呈弱阳性外，也均呈阴性。但四株移植瘤除ＰＬＡ－８０１Ｃ外，其余３株均呈α６Ａ强阳性。β１抗体及ＲＧＤ多肽对ＰＬＡ－８０１ＤＬ移植瘤的转移不见明显影响。结论：４株人肺癌移植瘤总体上呈β１亚族整合蛋白低表达，表达水平与其转移无显著相关。

一种新的突变SOD1转基因小鼠模型的构建及鉴定

目的构建表达一种新的突变SOD1(mSOD1)转基因小鼠模型,观察其临床表型,明确该mSOD1类型与肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)的发病关系。方法构建携带mSOD1基因的PCI质粒载体,通过受精卵原核注射的方法制备转基因小鼠。利用PCR方法鉴定出生的后代,采用转轮实验和足迹分析观察转基因小鼠的临床表型。结果 PCR结果证实获得了表达人mSOD1的转基因小鼠;行为学检测显示,转基因小鼠在转轮上停留时间为(59.17±26.27)s,明显短于野生型小鼠[(171.83±20.98)s,P<0.01],转基因小鼠在出生8个月左右出现双下肢跛行、拖曳,足迹欠规整,后肢足间距为(34.83±9.72)mm,明显小于野生型小鼠[(52.78±7.22)mm,P<0.01]。结论成功构建了mSOD1转基因小鼠,该转基因小鼠出现了类似ALS的临床表型。

不同限饲水平下巴马香猪血液生理、生化指标的比较

目的测定不同限饲水平下巴马香猪重要血液生理、生化指标,探讨限饲对血液生理生化指标的影响。方法将336头断奶巴马香猪根据不同限饲水平按完全随机法分为对照组、80%日粮组和50%日粮组,每组112头,在60日龄和90日龄前腔静脉采集血液样本,对重要的10项血液生理指标和7项血液生化指标进行测定,统计不同限饲水平下指标的差异。结果血液生化指标中ALT、TP、UREA和CREA指标值随着限饲水平的上升而上升;而TCHOL和GLU指标值随着限饲水平的上升而下降(P<0.05)。血液生理指标中RBC、HGB、HCT、MCH和MCHC指标含量随着限饲水平的上升而上升;而PLT、MCV、RDW-SD和RDW-CV指标含量随着限饲水平的上升而下降(P<0.05)。结论巴马香猪在3个限饲水平下,血液生理、生化指标存在明显差异;按80%日粮限饲的巴马香猪更能获得稳定标准的巴马香猪血液生理、生化指标。

慢病毒介导的CYP3A11基因knock-down小鼠的建立

目的构建和筛选小鼠P4503A11基因miR RNAi慢病毒载体,建立CYP3A11基因knock-down小鼠。方法利用Ravi Sachidanandam's Lab的在线软件设计沉默小鼠P4503A11基因的miRNA所对应的shRNA序列,PCR扩增后克隆到PCI-GFP-MiR质粒中,其再与慢病毒载体FUW进行重组。将psPAX2和pMD2.G两个载体和FUW-GFP-MiR-shRNA重组慢病毒载体共转染293FT细胞,包装成病毒。用包装好的病毒液感染293FT细胞后,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定。将上述重组慢病毒载体分别转染FVB/N小鼠肝细胞,转染48h后,检测P4503A11基因mRNA表达水平的变化。选取干扰效果最好的FUW-GFP-MiR-shRNA1重组慢病毒载体进行制备基因knock-down小鼠模型。用显微注射法将浓缩的shRNA1病毒液注射至FVB/N小鼠12细胞期胚胎透明带下。将注射后发育至22细胞期的胚胎移植至假孕受体母鼠,得F0代小鼠。在紫外光照射下利用滤光片观察GFP在小鼠活体内的表达水平。结果DNA测序结果显示3个重组慢病毒载体均与所设计的shRNA序列一致。检测的3个浓缩前慢病毒悬液的滴度均≥106TU/ml,经过高速离心对病毒进行浓缩和纯化,其滴度达到109TU/ml以上。转染FUW-GFP-MiR-shRNA1、2的2组肝细胞的P4503A11基因mRNA表达水平相对于空白对照组均显著下降(P<0.05),而转染阴性对照FUW-GFP-MiR-shRNA-NC的肝细胞P4503A11基因mRNA表达水平相对于空白对照组无明显改变。选用FUW-GFP-MiR-shRNA1慢病毒载体制备的F0代3A11基因knock-down小鼠,在紫外光照射下,阳性小鼠可见较强的荧光。结论构建并筛选出小鼠P4503A11基因有效的靶向miR RNAi慢病毒载体,并成功建立CYP3A11基因knock-down小鼠。

pBR002-HLA-DRB1＊ 0803转基因载体构建、表达及其抗原递呈功能研究

目的构建可以表达人类HLA-DRB1*0803的转基因载体,并在细胞水平验证其表达及抗原递呈功能。方法提取人WATANABE细胞株(基因型为HLA-DRB1*0803纯合子)的总RNA,RTPCR扩增DRB1*0803基因片段,与小鼠Eαpromoter和兔β-globin基因内含子序列同时导入p BR002-lacz载体。pBR002-HLA-DRB1*0803转基因载体转染小鼠DCS细胞和B细胞系,用Western blot和免疫荧光的方法对HLA-DRB1蛋白进行检测。流式细胞术检测转染小鼠DCS细胞对HBc Ag特异性CD4+T细胞的刺激和极化效应。结果经双酶切和测序验证,成功构建了p BR002-HLA-DRB1*0803转基因载体;转染载体后的小鼠DCS细胞和B细胞系均表达出了大小约为29×10~3的HLA-DRB1蛋白;免疫荧光结果表明HLA-DRB1蛋白主要表达于细胞质内。转染后的小鼠DCS细胞可将负载的HBcAg递呈给HLA-DRB1*0803阳性基因型的人CD4^+T细胞,产生明显的CD4^+T细胞应答。结论成功构建了HLA-DRB1*0803转基因载体,该载体可以在细胞水平特异性表达HLA-DRB1蛋白,并具有HLADRB1*0803特异性抗原递呈功能。

ApoE^(-/-)母体孕期高脂高胆固醇饮食对子代成年鼠动脉粥样硬化的影响

目的研究母体孕期高脂高胆固醇饮食对子代成年鼠动脉粥样硬化的发生影响。方法 ApoE-/-孕鼠分为高脂高胆固醇饮食组(G组)和普通饮食组(P组),G组雄性子代成年鼠分为高脂高胆固醇饮食组(G-G)和普通饮食组(G-P),P组子代雄性成年鼠继续喂养普通饲料(P-P),60 d后检测子代成年鼠总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)浓度,HE染色观察血管形态学变化及动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块形成情况。结果 G-G组和G-P组的TC、TG、LDL和HDL浓度较P-P组明显升高,且与P-P组相比TC浓度存在显著性差异(P<0.05),TG、LDL和HDL浓度存在极显著性差异(P<0.01);P-P组无AS斑块形成,G-G组与G-P组均有AS斑块形成,前者斑块形成率及斑块面积与血管管腔面积之比(PA/LA)都高于后者,两组PA/LA存在极显著性差异(P<0.01)。结论母体孕期高脂高胆固醇饮食对子代成年鼠动脉粥样硬化的发生具有重要影响。

胎猪皮肤前体组织异种移植研究

目的系统筛选猪胚胎皮肤前体组织异种移植的最佳妊娠时间窗，了解其创面修复能力。方法取胎龄35、42、56、70d的胎猪皮肤前体组织，制成微粒后移植于BABL／c裸鼠背部创面，以整形患者术后剩余皮肤或者成年猪皮覆盖。观察术后移植物生长发育特性，并于移植后6、12周取材，用组织学方法观察其形态结构及成瘤性。结果胎猪皮肤前体组织移植后具有如下特点：（1）能成活并继续生长发育，微粒可融合成片；胎龄35、42、56、70d的前体组织移植后12周，新生组织面积分别为（18±8）、（47±6）、（31±12）、（20±8）mm^2，其中胎龄42d的组织与其余三者比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。（2）新生（猪）皮肤组织具有表皮层和真皮层，真皮乳头明显。（3）能生长成为具有毛发、皮脂腺及汗腺等皮肤附属器的“完整”皮肤，且表皮层有黑素细胞。（4）胎龄56、70d的胎猪皮肤前体组织移植后未出现畸胎瘤。结论胎龄56d的胎猪皮肤前体组织可用于异种移植修复皮肤创面。