通过生物信息学技术预测铜绿假单胞菌噬菌体内溶素的作用机制

目的对20种铜绿假单胞菌噬菌体基因组中可能的内溶素基因进行生物信息学分析,探讨其可能的作用机制。方法采用开放阅读框预测、同源检索、多重序列比对、蛋白质模型自动匹配等方法预测可能的内溶素及其内溶素相关基因。结果通过铜绿假单胞菌噬菌体基因组进行分析,新发现8种内溶素基因和2种穴蛋白基因,对新发现基因的类型做了相关推定。结论利用生物信息学手段分析已知序列,可以迅速、方便、有效地确定未知基因的功能及作用方式。

SigB(Q225P)突变促进金黄色葡萄球菌生物被膜形成

目的探讨金黄色葡萄球菌Sig B(Q225P)突变对其生物被膜形成能力的影响。方法比较临床分离金葡菌(XQ株)与实验室传代获得菌落颜色变白之XQW株的生物学特性,通过结晶紫染色法以及激光共聚焦检测菌株的生物被膜形成。进行XQ及XQW全基因组测序,比较相关基因,寻找突变位点。分别扩增sigB(Q225P)基因及其上游片段,经酶切后连接穿梭载体p BT2,构建同源重组质粒p BT2-sigB(Q225P),电转化至金葡菌RN4220,再将经RN4220修饰后的质粒电转入Newman。利用p BT2质粒对温度敏感的特点筛选Newman-sigB(Q225P)。利用同样的方法构建sigB敲除菌株Newman-△sigB,并构建回补菌株Newman-△sigB/sigB以及Newman-△sigB/sigB(Q225P)。比较这些菌株的生物被膜形成差异。结果 XQW株在液体培养基中呈絮状生长,结晶紫法以及激光共聚焦检测结果显示其生物被膜形成能力显著强于野生株,全基因组测序和比较发现XQW的sigB基因发生(Q225P)突变。构建的同源重组质粒p BT2-sigB(Q225P)及p BT2-△sigB转化金葡菌Newman后,经筛选,获得Newman-sigB(Q225P)及Newman-△sigB菌株;回补质粒p LI50-sigB及p LI50-sigB(Q225P)转化Newman-△sigB,筛选获得回补菌株Newman-△sigB/sigB及Newman-△sigB/sigB(Q225P)。经过结晶紫染色法及激光共聚焦测定生物被膜,发现Newman-sigB(Q225P)较野生株的生物被膜形成能力显著升高,与XQW的生物被膜形成能力强于XQ野生型的表型相一致;Newman-△sigB/sigB(Q225P)的生物被膜形成能力明显高于Newman-△sigB/sigB。结论 Sig B(Q225P)具有促进金葡菌生物被膜形成的能力。

重庆地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌主要流行克隆更替的机制研究

目的探讨重庆地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株ST239-MRSA-Ⅲ-t030替代ST239-MRSA-Ⅲ-t037克隆的机制。方法选择重庆地区分离的ST239-MRSA-Ⅲ-t030和ST239-MRSA-Ⅲ-t037临床株,检测各菌株的生长曲线,观察菌落形态,分析菌株的药物敏感谱;再通过体外、体内竞争实验和交叉抑制实验深入探讨ST239-MRSA-Ⅲ-t030替代ST239-MRSA-Ⅲ-t037的机制。结果 ST239-MRSA-Ⅲ-t030菌株较ST239-MRSA-Ⅲ-t037有更短的生长迟缓期,后者在固体培养基上生长的菌落相对较小,且都对复方新诺明耐药,对利福平敏感,这与ST239-MRSA-Ⅲ-t030菌株不同(大多数对复方新诺明敏感,对利福平都耐药)。ST239-MRSA-Ⅲ-t030菌株在体外和体内都表现出比ST239-MRSA-Ⅲ-t037菌株更强的生存竞争优势,但两克隆的菌株间并不存在明显的交叉抑制现象。结论 ST239-MRSA-Ⅲ-t030克隆的生存竞争优势和独特的耐药表型可能是其成功替代ST239-MRSA-Ⅲ-t037而成为第一流行克隆的原因。

宏基因组研究高脂饮食诱导小鼠的肥胖易感性与肠道菌群的关系

目的考察高脂饮食喂养后小鼠肠道菌群在组成及功能上与肥胖易感的相关性。方法采用高脂饲料喂养C57BL/6J小鼠构建高脂饮食诱导肥胖组(high-fat-diet-induced-obesity,HFDIO)和高脂饮食诱导肥胖抵抗组(high-fat-diet-induced-obesity-resistant,HFDIOR)模型,正常饲料组为对照组,搜集并提取3组小鼠粪便样本细菌基因组,DNA质检后挑取高质量样本(每组6个),采用Illumina公司的Hiseq2000进行细菌宏基因组测序及相关生物信息学与统计学分析。结果较之对照组,肥胖组和肥胖抵抗组小鼠肠道厚壁菌门、变形菌门、脱铁杆菌门含量显著升高,拟杆菌门显著下降(P<0.05)。肥胖组和肥胖抵抗组小鼠肠道的特征菌种组成显著不同,且毛螺菌科中的Lachnospiraceae bacterium 10_1与Lachnospiraceae bacterium 28_4分别为肥胖及肥胖抵抗组小鼠的关键菌种;肥胖与肥胖抵抗小鼠肠道菌群的功能及代谢显著差异则主要集中在碳水化合物代谢、核酸代谢与锚定、膜转运活性及转移酶活性等方面。结论不同个体对于饮食诱导的肥胖的易感性差别可能与肠道菌群组成及功能变化相关,这有助于正确评价肠道菌群在肥胖发生中的作用。

广州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子分型及耐药性分析

目的了解广州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)分子型别及其对临床常用抗生素的耐药情况,为防控MRSA感染提供依据。方法收集2010年10月至2011年4月广州地区两家教学医院临床分离的MRSA 142株,应用SCCmec、spa、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)等方法进行分子分型,检测这些菌株对苯唑西林、克林霉素等17种临床常用抗生素的药物敏感性,分析临床MRSA的耐药情况。结果 142株MRSA中121株为医院获得型金葡菌(HA-MRSA),20株为社区获得型金葡菌(CA-MRSA),1株未定型MRSA。这些MRSA可分为16种spa型,8种ST型及13种PFGE型。HA-MR-SA中的ST239-MRSA-Ⅲ-t030、ST239-MRSA-Ⅲ-t037和ST5-MRSA-Ⅱ-t002为主要流行克隆,也发现CA-MRSA中ST59-MR-SA-Ⅳ-t437克隆的流行,且这些流行克隆有特定的耐药谱。结论广州地区流行的金葡菌仍以HA-MRSA为主,同时也有一定量的CA-MRSA检出和传播,且CA-MRSA的多重药物敏感性已在下降。

乌鲁木齐地区金黄色葡萄球菌分离株的分子分型与耐药性分析

目的了解乌鲁木齐地区金黄色葡萄球菌临床分离株的分子特征及其对临床常用抗生素的耐药情况。方法收集2010年6月至2012年12月期间乌鲁木齐地区一所大型综合医院临床分离的86株金黄色葡萄球菌,在鉴定区分耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,MSSA)的基础上,应用SCCmec分型、spa分型、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、脉冲场凝胶电泳分型(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)、agr分型等葡萄球菌分子分型方法进行分析,检测pvl毒力基因的携带率,检测菌株对苯唑西林、红霉素、四环素等13种临床常用抗生素的耐药性,分析菌株的耐药情况及耐药基因。结果 86株金葡菌中31株为MRSA,55株为MSSA。31株MRSA分为8种spa型和7种ST型,优势流行克隆为ST239-MRSA-Ⅲ-t030(71%,22/31)。55株MSSA分为23种spa型、16种ST型和8个PFGE聚类组,agrⅠ型占56.4%(31/55)。MSSA菌株的pvl毒力基因检出率为49.1%(27/55),MRSA为38.7%(12/31)。药敏结果显示31株MRSA均为多重耐药(multidrugresistant,MDR)菌株,55株MSSA中有31株为MDR菌株。结论乌鲁木齐地区流行的MRSA以ST239-MRSA-Ⅲ-t030为主,而MSSA表现出较高遗传多样性,发现有t11413,ST121等新的型别流行。

革兰阴性菌基因敲除载体的构建及其应用

目的构建1个适用于革兰阴性菌的精确基因敲除载体并证明其有效性。方法构建的载体主要包括以下成分:π蛋白依赖性复制起点oriR6K;接合转移基因mob,使载体可以通过简单的接合方式实现转移;多克隆位点序列:EcoRⅠ-XbaⅠ-ApaⅠ-SfiⅠ-SacⅠ-NotⅠ-SpeⅠ-NdeⅠ-SacⅡ-BglⅡ;反向选择标志SacB;正向选择标志卡那霉素抗性片段。载体构建完成后,采用该载体对弗氏枸橼酸杆菌的yeeZ基因进行框架内敲除,以验证其有效性。结果成功构建了敲除载体,命名为pYG4,并对yeeZ基因进行了框架内精确敲除获得突变株。结论本研究构建的载体适用于对革兰阴性菌进行目的基因的精确敲除,将在细菌基因功能研究中得到广泛的应用。

金黄色葡萄球菌agr基因敲除及其对膜泡毒力影响

目的利用同源重组技术构建金黄色葡萄球菌RN4220附属基因调节系统(agr)的敲除株,探讨agr基因缺失对金黄色葡萄球菌分泌膜泡毒力的影响。方法分别扩增agr基因的上下游同源臂,利用重叠PCR获得agr基因上下游同源臂的融合片段,经酶切后连接敲除载体PYT3,构建同源重组质粒pYT3::Δagr,电转化至金黄色葡萄球菌RN4220,利用pYT3质粒对温度敏感的特点筛选agr缺失的突变株。分别制备野生菌RN4220和突变株RN4220::Δagr的膜泡,小鼠毒力实验观察agr基因缺失后对金黄色葡萄球菌膜泡毒力的影响。结果同源重组质粒pYT3::Δagr通过酶切鉴定证明构建成功;经PCR及DNA测序证实获得金黄色葡萄球菌RN4220 agr缺失突变株,重组效率为5.6%;agr突变株与野生株相比,其分泌膜泡的毒力大大降低,72 h内小鼠存活率为100%。结论 agr基因缺失后能够显著降低膜泡的毒力。

广州2002年登革病毒流行株的分离鉴定及进化分析

目的 从 2 0 0 2年广州采集的可疑登革病人血清中分离登革病毒 ,明确流行株的血清型及基因型 ,并鉴定该分离株的毒力。方法 采集疑似登革热患者血清 2 0份 ,应用C6 3 6细胞体外培养的方法进行病毒分离 ,并合成登革病毒通用引物 ,进行逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)后 ,将PCR扩增产物克隆到T载体进行序列测定和比对。确定血清型后 ,进一步扩增在病毒进化上有代表意义的病毒血清型特异性E NS1连接区基因片段 ,测序后用邻位相连 (N J)法构建登革病毒进化树 ,分析此次登革病毒流行株的来源。通过乳鼠脑内接种及空斑实验 ,测定分离株的毒力。结果 上述 2 0份血清标本中 ,5份标本出现明显的细胞病变 ,主要表现为细胞融合 ,形成大小不一的空泡和网状结构。RT PCR扩增、序列测定证实为登革病毒Ⅰ型。E NS1连接区基因序列片段分析表明 ,2 0 0 2年广州分离株 (DEN 1 GZ2 0 0 2 )的核苷酸序列与基因型Ⅳ型的DEN 1 T14株 (澳大利亚 ,1981)同源性最高 ,达 98%。N J法构建进化树显示 :11株DEN 1病毒分成 3个基因群 ,分别与Rico Hesse 1990分型中的Ⅰ ,Ⅳ和Ⅴ型以及AnaP .Goncalvez 2 0 0 2年分型中的亚洲型 ,南太平洋型和美洲 非洲型相符 ,本室分离的DEN 1 GZ2 0 0 2株属于Ⅳ型或者称南太平洋型。DEN 1 GZ2 0 0 2?

铜绿假单胞菌噬菌体PaP1内溶素基因克隆、表达及活性分析

目的构建铜绿假单胞菌噬菌体内溶素重组原核表达载体,检测重组蛋白的酶学活性及抑菌活性。方法利用重组技术将铜绿假单胞菌裂解性噬菌体PaP1内溶素基因构建到表达载体pQE31中,并在大肠杆菌M15(pREP4)中诱导表达,通过非变性方法纯化重组融合蛋白,利用酶谱电泳、抑菌实验等技术检测酶学活性及抑菌活性。结果酶谱电泳方法结果显示重组融合蛋白对铜绿假单胞菌细胞壁肽聚糖有降解作用,抑菌活性检测结果显示重组融合蛋白对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌效果。结论该研究从实验方面证实了噬菌体PaP1内溶素基因的生物学功能。

猪链球菌2型中国强致病株05ZYH33荚膜缺陷菌株的构建

目的构建猪链球菌2型(Streptococcus suisserotype 2,S.suis2)中国强致病株05ZYH33荚膜缺陷株。方法利用同源重组基因敲除方法获得S.suis2强毒株05ZYH33荚膜合成基因cps2B敲除突变株,通过小鼠攻毒实验证实荚膜缺陷株对细菌毒力的影响。结果PCR和Southern杂交结果均显示cps2B基因完全被壮观霉素抗性基因替代,表明基因敲除突变体构建成功。电镜结果证实突变体荚膜合成能力缺失,小鼠致病性实验结果显示突变体毒力基本丧失。结论成功构建05ZYH33荚膜缺陷株,提示菌体荚膜多糖成分对于猪链球菌2型侵袭和致病具有显著作用。

慢病毒携带shRNA对宫颈癌细胞中HPV16型E6表达的抑制作用

目的研究慢病毒携带的短发夹状干扰RNA(short hairp in RNA,shRNA)对宫颈癌Cask i细胞中人乳头瘤病毒(hum an pap illom a virus,HPV)16型E6表达的抑制作用。方法将靶向HPV16型E6的shRNA表达序列克隆到改建的慢病毒表达载体PLL3.7中,经限制性酶切鉴定和测序后,与3种包装质粒混合,以L ipofectam ine 2000包裹后转染293FT细胞,72 h后收取含病毒的上清液并感染宫颈癌Cask i细胞,感染48 h后加入G418筛选阳性克隆。每天对阳性细胞克隆进行细胞计数;提取细胞总mRNA,进行RT-PCR反应。结果与对照组相比HPV16型E6的表达降低70%,宫颈癌Cask i细胞生长速度减慢50%。结论慢病毒携带的短发夹状干扰RNA能干扰宫颈癌细胞中HPV16型E6的表达并有抑制癌细胞生长的作用。

光化学作用增强阳离子聚合物介导EGFP转染结肠癌

目的观察光化学基因转染技术对阳离子聚合物介导目的DNA转染结肠癌细胞效率的影响。方法以结肠癌细胞SW 480、HT29为靶细胞,激光共聚焦显微镜观察光敏剂TPPS2 a的胞内分布,MTT法观察基于TPPS2 a的光化学作用对结肠癌细胞的生长抑制作用,同时以阳离子聚合物PEI为DNA载体,EGFP质粒为目的DNA,通过流式细胞技术对比观察光化学作用对阳离子聚合物介导EGFP质粒转染结肠癌细胞的影响。结果TPPS2 a在2种结肠癌细胞系呈颗粒状分布于细胞质;基于TPPS2 a的光动力效应对结肠癌细胞的生长抑制作用随光照剂量增大而逐渐加大,SW 480细胞取得IC50的光照时间为约6 m in,而HT29取得IC50的光照时间为约12 m in;与单纯质粒转染组和阳离子聚合物转染组相比,光化学作用可将阳性细胞率分别提高至(29.61±1.15)(SW 480细胞)和(23.47±0.62)(HT29细胞)(P<0.05)。结论TPPS2 a的胞内分布与内吞密切相关;基于TPPS2 a的光化学细胞毒性作用呈剂量依赖性;与单纯质粒转染组和阳离子聚合物转染组相比,光化学作用可明显提高阳离子聚合物介导转染目的DNA的阳性细胞率。

结核抗原特异性CD4^＋中央型记忆T细胞的检测及分布特性研究

目的比较活动期肺结核患者和纯蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)试验阳性健康人记忆T细胞的产生和分布特性。方法取乙二胺四乙酸(ethylene diaminete traacetic acid,EDTA)抗凝静脉血,Ficoll进行密度梯度离心获取PBMCs。采用卡介苗刺激后,通过CD4、CD154、CCR7、CD45RA4种抗体共染色,用流式细胞仪检测结核抗原特异性CD4+记忆T细胞。结果以CD4+CD154+双阳性区设门,研究结核抗原特异性CD4+记忆T细胞,结果显示,肺结核患者CD4+CD154+CD45RA-CCR7+中央型T淋巴细胞亚群分布频率显著降低(P<0.05),CD4+CD154+CD45RA+CCR7+初始T细胞亚群的比例明显增高(P<0.05)。结论肺结核患者CD4+中央型记忆T淋巴细胞亚群的产生存在异常,可能与免疫功能低下和结核病发病密切相关。

利用DNA免疫技术制备抗登革2型病毒NS2B蛋白多克隆抗体

目的构建登革2型病毒(dengue virus serotype2,DV2)非结构蛋白NS2B的真核表达质粒pCAGGS-P7/NS2B,进行DNA免疫,制备小鼠抗NS2B特异性多克隆抗体。方法PCR扩增DV2-NS2B基因片段,构建真核表达载体pCAGGS-P7/NS2B,采用脂质体介导的方法转染Vero细胞,检测目标蛋白的表达。用该表达质粒免疫BALB/c小鼠,制备抗NS2B抗血清。结果成功构建真核表达重组质粒pCAGGS-P7/NS2B,该重组质粒具有良好的免疫原性,免疫小鼠后所获的抗血清,抗体效价达1∶3200,Western blot和间接免疫荧光证实抗血清能特异性地识别DV2-NS2B蛋白。结论通过DNA免疫所制备小鼠抗DV2-NS2B抗血清能特异性地识别DV2-NS2B蛋白。

转录因子Blimp-1的原核表达、纯化及抗体制备

目的获得B limp-1纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究浆细胞发育的调控奠定基础。方法采用PCR方法从B limp-1质粒中克隆B limp-1编码前350个氨基酸的基因片段,构建B limp-1与6个H is的融合蛋白原核表达质粒,进行原核表达与蛋白纯化后,免疫动物,制备B limp-1多抗。采用ELISA方法检测其效价,W estern检验抗体特异性及在骨髓瘤细胞株中的表达。结果构建了表达B limp-1前350个氨基酸的原核表达质粒PQE-B limp-1,经过大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,得到分子量约46×103的融合蛋白,免疫家兔后得到多抗血清。ELISA显示抗体效价达1/20 000。W esternb lot结果显示此多克隆抗体与B limp-1蛋白特异性结合,并在骨髓瘤细胞中表达。结论本研究获得B limp-1纯化蛋白,制备了B limp-1多克隆抗体,为进一步研究B limp-1的作用机制及与血液疾病间的关系奠定了基础。

难测序噬菌体基因组PaP1的大片段克隆及测序

目的采用大片段克隆策略对难测序铜绿假单胞菌噬菌体PaP1基因组进行克隆及测序。方法用限制性内切酶AatⅡ将噬菌体PaP1基因组DNA切成几个大片段,分别进行末端修饰后与线性化的大片段克隆载体pYLTAC7连接,将连接产物电转化感受态细胞,筛选阳性克隆进行测序。结果AatⅡ将PaP1基因组切成8个片段,通过大片段克隆共获得3个阳性克隆,测出插入片段大小分别为9 805、8 335 bp和3 465 bp,使该难测序基因组的测出量达到47 757 bp。结论大片段克隆策略能够克服鸟枪法测序的不足,将有望获得噬菌体PaP1的全基因组序列。

人sCR1结合C3b结构域基因的克隆及在大肠杆菌中高效表达

目的克隆表达人可溶性补体受体1型(sCR1)结合C3b结构域基因。方法从外周血单核细胞中提取总RNA,RT-PCR克隆编码sCR1-SCR15-18的cDNA,连接pMD-18T载体进行DNA序列分析,再亚克隆pET32原核表达载体,构建pET32-sCR1-SCR15-18重组表达载体,转化BL21菌,用IPTG诱导表达,表达产物通过免疫印迹实验鉴定。结果获得了预期的扩增目的片段,成功构建了pMD-18T重组克隆载体,核苷酸测序结果与GenBank登录的人sCR1-SCR15-18 cD-NA序列一致。成功的构建了原核表达载体pET32-sCR1-SCR15-18,目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%,并在菌体内形成包涵体。免疫印迹实验显示,在分子量约43×103处出现单一条带的阳性结果。结论从单核细胞中克隆出sCR1-SCR15-18片段基因,人sCR1-SCR15-18在大肠杆菌中得到高效表达。

萋-尼染色导致的总挥发性有机物污染及其控制方法

目的建立一种改良抗酸染色冷染方法,用以控制实验室总挥发性有机物(total volatile organic compound,TVOC)污染。方法采用TVOC检测仪定量测定实验室内空气中的苯系物和TVOC污染程度;以卡介苗(bacillecalmette-guerin,BCG)为染色标本,配制含有1%Triton X-100标本稀释液和初染液,建立不用加温助染的抗酸染色冷染法替代传统抗酸染色法。结果传统萋-尼抗酸染色时,室内TVOC污染在12 min时间点即高达1 014 ppb(约1 mg/m^3),成倍超过国家室内卫生标准(GB50325-2010)规定值(500 ppb,即0.5 mg/m^3);同样条件下,用改良冷染法染色期间,室内TVOC量有所增加,但在试验期间最高值为387 ppb,保持在国家室内卫生标准容许限度以下;利用Triton X-100建立的改良抗酸冷染法具有抗酸染色特性,其对抗酸杆菌的可检测度为3×10^(-6)~6×10^(-5)CFU/mL。结论抗酸染色冷染法可用于替代传统萋-尼抗酸染色,从而控制实验室的TVOC污染问题。

人CR1-SCR1-3蛋白对急性大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨补体活化在大鼠急性脑缺血再灌注中的作用及人补体受体1型SCR1-3蛋白(CR1-SCR1-3)的保护作用。方法健康雄性SD大鼠75只,采用完全随机设计分组法分为假手术组(n=15)、CI/R组(n=30)及CI/R+CR1-SCR1-3组(n=30)。线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞模型,缺血1 h,再灌注24 h,对大鼠进行行为学检测,记录神经功能缺陷评分;TTC染色法测定脑梗死体积;制作脑匀浆测定大脑皮层髓过氧化物酶(MPO)活性、丙二醇(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性;制备切片观察大脑皮质区补体C4b沉积及病理改变。结果缺血再灌注24 h后,CR1-SCR1-3蛋白可明显改善CI/R+CR1-SCR1-3组大鼠神经功能(P<0.05);脑梗死体积亦明显减少(P<0.01);与CI/R组比较,CI/R+CR1-SCR1-3组MPO活力、MDA含量显著降低(P<0.01),而SOD活性显著增高(P<0.01);缺血脑组织皮质区原位补体C4b沉积显著减少(P<0.01),病理损伤亦明显减轻。结论补体活化参与了脑缺血再灌注损伤过程,CR1-SCR1-3蛋白对大鼠急性CI/R损伤具有保护作用。