AdPPO4基因部分序列的cDNA克隆与序列分析

目的 克隆大劣按蚊 (Andirus)前酚氧化酶 (prophenoloxidase ,PPO)基因部分序列。方法 根据已报道的多种昆虫以及冈比亚按蚊PPO基因编码的保守氨基酸序列设计简并引物 ,以大劣按蚊幼虫总RNA为模板进行RT PCR扩增 ,目的片段经TA克隆后测定其核苷酸序列 ,然后进行序列查询与比对。结果 从大劣按蚊幼虫中获得的PPO4基因(AdPPO4)部分序列长 5 97bp ,编码 199个氨基酸 ;AdPPO4与冈比亚按蚊PPO4基因的核酸和氨基酸序列同源性分别达 84%和 90 %。结论 从大劣按蚊幼虫中成功地克隆出了AdPPO4基因的部分序列 。

大劣按蚊TEP1 cDNA的克隆和生物信息学分析

目的克隆大劣按蚊(Anopheles dirus)含硫酯键蛋白1(thioester-containing protein 1,TEP1)的cDNA,并分析其序列。方法根据已报道的冈比亚按蚊等多种昆虫的TEP1氨基酸保守序列设计简并引物,以大劣按蚊血淋巴细胞总RNA为模板,进行RT-PCR扩增。对目的片段纯化回收,经TA克隆后测定其核苷酸序列。利用DNASIS程序分析该序列,并推导其氨基酸序列,最后利用BLAST和DNASIS等进行不同昆虫TEP1氨基酸序列的比对。结果RT-PCR扩增出一约770 bp的条带,TA克隆后DNA测序发现,阳性克隆的核苷酸序列长774 bp,推导其氨基酸序列长258 aa。生物信息学分析表明,该序列与冈比亚按蚊、阿拉伯按蚊、斯氏按蚊TEP1基因的氨基酸序列同源性分别达72%、72%和59%,与冈比亚按蚊的TEP4氨基酸序列同源性为59%。结论从大劣按蚊血淋巴细胞中成功克隆出了TEP1的cDNA部分序列。

羟基喜树碱脂自制质体注射液与市售注射液家兔体内药代动力学行为的比较

目的 比较自制羟基喜树碱脂质体注射液 (hydroxycamptothecinliposomesinjection ,L HCPT)和市售羟基喜树碱注射液 (markethydroxycamptothecininjection ,M HCPT)在家兔体内的药代动力学行为。方法 分别静脉注射单剂量 ( 1mg kg)的L HCPT和M HCPT ,用HPLC法测定血浆中的药物浓度 ,用 3p87程序和SPSS软件处理和分析数据 ,计算有关药代动力学参数。结果 经 3p87程序拟合 ,家兔静脉注射单剂量L HCPT和M HCPT后 ,其血药浓度 时间数据分别符合权重为1 C C的二室模型 ;静脉注射L HCPT和M HCPT后Cmax分别为 3 1768、1 5 2 19μg ml,t1 2 β分别为 3 3 990 7、2 9 3 92 9min ,AUC分别为 2 8 85 15、11 65 5 1μg·min·ml- 1 ,CL分别为 0 .0 3 5 0、0 0 860L·min- 1 ·kg- 1 ,Vc分别为 0 2 70 0、0 64 0 0L kg ,可见L HCPT比M HCPT注射后具有更高的血药浓度水平 ,较长的消除半衰期 ,更大的血药浓度 时间曲线下面积 ,较低的总体清除率和较小的表观分布容积。结论 L HCPT和M HCPT在家兔体内的一些重要的药代动力学特性发生了明显改变 。

大劣按蚊血淋巴酚氧化酶与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的 探讨大劣按蚊血淋巴酚氧化酶 (PO)与约氏疟原虫卵囊黑化的关系。方法 以大劣按蚊 /约氏疟原虫模型 ,利用聚丙酰凝胶电泳后的酶底物显色法 ,比较、分析血餐后 5、7、11、15d时不吸血组、吸正常血组和感染组 3组的雌大劣按蚊血淋巴酚氧化酶的单酚氧化酶 (MPO)和双酚氧化酶 (o DPO)活性 ;同时观察感染组约氏疟原虫的感染度及其卵囊黑化比率。结果 感染组的血淋巴MPO和o DPO酶活性明显高于不吸血组和吸正常血组 (P <0 .0 5 ) ;但是随着约氏疟原虫卵囊黑化比率的增高 ,感染组血淋巴MPO和o DPO活性逐渐下降。另外 ,吸正常血组的MPO和o DPO酶活性明显高于不吸血组 (P <0 .0 5 )。结论 吸血和约氏疟原虫的感染均能激活大劣按蚊前酚氧化酶级联反应 。

木犀草素脂质体制剂处方和工艺优化研究

目的优化制备注射用木犀草素脂质体的处方工艺。方法采用薄膜分散法和冻干工艺进行木犀草素脂质体制备,并以载药量、包封率为评价指标,优化制备处方和工艺。结果木犀草素脂质体制备的最佳工艺处方为磷脂∶木犀草素10∶1,磷脂∶胆固醇4∶1,水化介质为注射用水,温度为50℃。按照此处方工艺制备的木犀草素脂质体平均载药量、平均包封率、平均粒径分别为7.21%、66.8%、278.4nm。结论按优化处方和工艺制备的木犀草素脂质体各项指标基本符合静脉应用要求。

采用Ⅳ型胶原酶构建大鼠脑出血模型

目的 利用Ⅳ型胶原酶构建大鼠脑出血模型 ,并研究血肿形成速度和血肿形成大小的影响因素。方法 使用健康雄性 2 0 0～ 2 5 0gWistar大鼠 ,随机分组 ,分别脑内尾状核注射不同容积Ⅳ型胶原酶 肝素生理盐水溶液、单纯Ⅳ型胶原酶生理盐水溶液、单纯生理盐水 ,于术后 6h、12h、2 4h、3d、7d分别观察冰冻切片连续切片血肿大小。结果 单纯生理盐水注射仅引起 12h内的针道渗血 ,单纯胶原酶生理盐水注射 3d可以形成直径 3mm左右的血肿 ,Ⅳ型胶原酶 肝素生理盐水注射 2 4h可形成直径 3mm左右的血肿。结论 Ⅳ型胶原酶 肝素生理盐水注射可以建立理想稳定的脑出血动物模型 。

G-CSF动员循环间充质干细胞及其对小鼠颅脑损伤修复的可行性分析

目的建立小鼠严重颅脑创伤模型探讨粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)动员循环间充质干细胞(mesenchym alstem cells,MSCs)的可行性,并观察G-CSF动员的修复效应。方法以G-CSF作为动员剂,培养骨髓和外周血来源的MSCs,计数动员前后的CFU-F。制作小鼠严重颅脑创伤模型,致伤后采用G-CSF对MSCs进行动员,在2、24、48、96、120、144、192、264、336h进行神经行为学评分、运动功能评分,并观察小鼠死亡率和病理组织切片。结果从小鼠外周血培养出MSCs,G-CSF动员后骨髓和外周血MSCs的CFU-F数量显著高于正常对照组(P<0·01)。致伤后小鼠神经行为学和运动功能评分显著低于正常对照组(P<0·01),创伤治疗组在144～192h期间评分显著高于创伤组(P<0·05)。致伤后小鼠死亡率增高,病理切片可见创伤处有出血和空泡。结论成功培养及用G-CSF动员了外周血MSCs,在成功建立小鼠严重颅脑创伤模型的基础上,显示G-CSF动员可以降低严重颅脑创伤小鼠死亡,参与了创伤修复。

温度对冻干脂质体物理化学稳定性的影响研究

目的 研究温度对冻干脂质体物理化学稳定性的影响。方法 应用激光粒度仪检测冻干脂质体水化后的粒径变化 ,评价其物理稳定性 ;通过检测脂质二级过氧化物与硫代巴比妥酸反应物的吸光度和滴定分析脂质水解产物棕榈酸的方法 ,观察其化学稳定性。 2 5d内 ,分别对以密闭闭光形式分别储存于 -18、4、2 5、40℃等条件下的冻干脂质体氧化、水解和粒径等性质进行观察。结果 冻干脂质体在 40℃条件下时氧化程度明显高于 -18、4、2 5℃ ,随着温度的升高 ,氧化速度有升高的趋势 ;4种条件下的冻干脂质体产生的游离脂肪酸虽然都有一定程度升高 ,但变化较小 ,且没有明显差异。粒径在 40℃、第 2 5天时变化较大 ,其它经统计学处理没有显著性差异。结论 温度对冻干脂质体的化学稳定性影响较大 ,而对物理稳定性影响较小 。

姜黄素-3单体脂质体的研制及评价

目的制备包封率高、粒径均匀、稳定性好的姜黄素-3(双脱甲氧基姜黄素,demethoxycurcumin)单体脂质体。方法通过均匀设计筛选工艺,以乙醇注入法等制备姜黄素-3脂质体。结果制备姜黄素-3脂质体平均粒径为130.5nm,分布均匀,平均包封率为87.89%,稳定性好。结论以脂质体技术包裹姜黄素-3单体形成脂质体制剂可行,为进一步研究在肿瘤治疗中的应用提供了基础。

大鼠脑出血后细胞凋亡和bcl-2表达间关系的研究

目的 研究脑出血后血肿周围水肿带内细胞凋亡与bcl 2表达的关系。方法 使用胶原酶法建立大鼠脑出血模型。于脑出血后 6、12、2 4h、3、7d选取血肿灶周围脑组织制成冰冻切片 ,对切片进行相应染色 :用TUNEL法观察血肿灶周围细胞凋亡 ,通过免疫组化和原位杂交方法分别从mRNA和蛋白的水平观察bcl 2的表达。对染色结果进行图像分析及统计学处理 ,分析细胞凋亡与bcl 2表达的关系。结果 脑出血 6h后血肿周围出现TUNEL阳性细胞 ,此时bcl 2的表达降低 ;之后凋亡细胞数量逐渐增加 ,至 3d达到高峰 ,此时bcl 2的表达仍处于低水平 ;3d至 7d凋亡细胞数量减少 ,而bcl 2的表达增加。结论 脑出血后血肿周围存在细胞凋亡 ,而bcl

脑型疟发生的免疫病理机制

脑型疟(cerebral malaria)是疟疾感染的严重并发症,近年来其发生的免疫病理学机制受到极大关注。早期的研究认为,脑型疟的发生主要与感染疟原虫的红细胞和脑血管内皮细胞黏附,导致脑血管阻塞有关。然而,越来越多的证据表明,脑型疟的发生主要由疟原虫感染后引起的免疫病理反应所导致,与炎症因子的过量释放和免疫细胞在脑血管的浸润密切相关。本文就近年来脑型疟发生的免疫病理机制的研究进展作一综述。

斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段的克隆和序列分析

目的 克隆斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段 ,获得其序列 ,并进行序列分析。方法 利用简并引物 ,进行RT PCR ,扩增斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段。TA克隆装入pUCm T载体 ,进行鉴定、测序 ;利用DNASIS程序推导其所编码的氨基酸序列 ,并与相关虫种半胱氨酸蛋白酶进行氨基酸序列的同源性分析。结果 RT PCR扩增出了一 5 0 0bp左右的cDNA片段 ,对阳性克隆测序后获得其核酸序列 ,长 498bp。推导出的氨基酸序列长 166;氨基酸序列的同源性分析显示 ,该序列与相关虫种半胱氨酸蛋白酶存在着很高的同源性 ,组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守。

免疫组化技术对斯氏狸殖吸虫成虫免疫诊断相关抗原的初步研究

目的初步分析斯氏狸殖吸虫成虫表膜和肠相关抗原,探讨肺吸虫病的免疫诊断的特异性诊断抗原。方法斯氏狸殖吸虫成虫制备成15μm的冰冻切片,肺吸虫患者血清识别斯氏狸殖吸虫成虫特异性抗原,采用免疫金标记和免疫酶标记检测技术对抗原进行定位,激光共聚焦显微镜技术进行半定量分析以及免疫透射电镜对其细微结构的观察。分实验组和对照组。结果肺吸虫患者血清识别的斯氏狸殖吸虫成虫抗原定位于虫体的表膜和肠腔,表膜抗原半定量分析平均灰度值为80.65,肠腔抗原半定量分析平均灰度值为71.26,电镜下可见胶体金附着于肠腔和表膜的双层结构。结论肺吸虫患者血清识别的斯氏狸殖吸虫成虫抗原都为表膜相关抗原和肠相关抗原,因此与肺吸虫病免疫诊断相关的诊断抗原为虫体表膜和肠上皮产生的相关蛋白。

昆虫天然免疫的研究进展

对果蝇等昆虫天然免疫的研究有利于揭示人类自身的免疫机制,并为感染性疾病和自身免疫病等的治疗提供新思路。昆虫的天然免疫机制包括物理防线、体液免疫和细胞免疫等方面。在病原体入侵昆虫体内后,昆虫可通过模式识别机制识别病原体并通过Toll途径和Imd途径等机制启动昆虫的体液及细胞免疫反应。昆虫的体液免疫和细胞免疫并不是绝然独立的,而是相互联系、相互促进和协作。在昆虫的各种免疫反应中,抗菌肽的产生、黑化包被反应和细胞吞噬作用是最为重要的防御机制。

约氏疟原虫卵囊黑化期间大劣按蚊血淋巴蛋白的分析

目的 初步探讨大劣按蚊 (Anophelesdirus)黑化包被约氏疟原虫 (Plasmodiumyoelii)卵囊相关蛋白。方法 挤压法分别收集血餐后第 1、3、4、5天时不吸血组、吸正常血组和感染组的雌大劣按蚊血淋巴 ,经SDS PAGE分离后 ,银染显色。同时 ,用烟草天蛾 (ManducaSexta)前酚氧化酶 (Prophenoloxidase ,PPO)亚基 1IgG检测正常雌大劣按蚊血淋巴中的PPO。结果 SDS PAGE发现感染约氏疟原虫后 ,部分大劣按蚊的血淋巴蛋白带增强 ,而部分血淋巴蛋白带却减弱 ,免疫印迹发现大劣按蚊血淋巴PPO有 87× 10 3 、6 7× 10 3 、6 3× 10 53条蛋白带 ,而相应分子量的 3条蛋白带在约氏疟原虫感染后第 4、5天开始增强 ,其中尤以 87× 10 3 的增强最为明显。

日本血吸虫和斯氏并殖吸虫的rDNA-ITS2遗传多态性研究

目的分析日本血吸虫和斯氏并殖吸虫的核糖体DNA第二内转录间隔区(rDNA-ITS2)基因的遗传变异。方法采集2种吸虫成虫标本,提取其基因组DNA,PCR特异性扩增rDNA-ITS2基因并测序;Clusterx软件进行多序列对比;MEGA4软件计算遗传距离,NJ法和MP法构建系统进化树;DNAsis软件对rDNA-ITS2序列片段进行模序分析。结果2种方法构建的遗传系统进化树基本结构相似,日本血吸虫与斯氏并殖吸虫间存在较远的遗传距离,但二吸虫ITS2序列间有42.7%的相似性。利用DNAsis软件在日本血吸虫和斯氏并殖吸虫的rDNA-ITS2序列中发现AP_2_CS6、bHLH_CS和CAP_site3种相同的转录因子。结论日本血吸虫和斯氏并殖吸虫虽然在rDNA-ITS2基因水平上存在明显种间差异,但在rDNA-ITS2序列、转录因子方面具有重要的相似性。

大劣按蚊含硫脂蛋白基因在约氏疟原虫感染中的作用

目的分析大劣按蚊含硫脂蛋白(TEP1)基因在约氏疟原虫感染过程中的作用。方法根据GenBank中大劣按蚊TEP1基因序列设计带有T7启动子的引物,以大劣按蚊cDNA为模板,进行PCR扩增,纯化产物,体外转录试剂盒合成AdTEP1双链RNA。羽化1～2日的雌性大劣按蚊分3组(200只/组):TEP1干扰组、绿色荧光蛋白(EGFP)干扰组和对照组。TEP1、EGFP干扰组按蚊分别进行胸部微量注射AdTEP1双链RNA、EGFP双链RNA各147 ng,对照组未处理。干扰后3d,每组取15只按蚊,去头,以大劣按蚊核糖蛋白S7(AdS7)为内参进行半定量PCR,检测干扰效果。干扰后4d,用约氏疟原虫BY256荧光株感染3组大劣按蚊。感染后9d,每组各解剖25只蚊胃,记录感染率和感染度。结果对照组和EGFP干扰组AdTEP1的表达条带亮度基本一致,而TEP1干扰组AdTEP1的表达条带亮度非常微弱。感染后9 d,蚊胃卵囊数统计学分析表明,对照组、EGFP干扰组和TEP1干扰组感染率分别为(24±2.83)%、(24±0.71)%和(80±3.54)%;感染度分别为0.32±0.7、0.44±0.85和5.52±4.84,TEP1干扰组明显高于对照组和EGFP干扰组(P<0.05)。结论 AdTEP1干扰后明显增加了大劣按蚊的感染率和感染度,增强了大劣按蚊对约氏疟原虫易感性。