基于Antares2的金黄色葡萄球菌生物发光示踪系统的构建

目的构建融合型荧光素酶标记的金黄色葡萄球菌示踪菌株,建立金葡菌示踪系统。方法采用同源重组技术将融合型荧光素酶Antares2编码基因敲入到金葡菌USA300基因组中,与金葡菌烯醇酶编码基因eno融合,构建稳定表达的示踪菌株。将示踪菌株与不同的底物混合,检测生物发光强度差异,筛选合适的菌株/底物示踪系统,并探究其在体外和体内的敏感性。结果通过构建基因敲入质粒pBT2-eno-antares2,转化金葡菌USA300菌株中进行基因敲入菌株筛选,经DNA测序和Western blot鉴定示踪菌株USA300/Eno-Antares2构建成功。细菌生长曲线和溶血实验表明所构建的示踪菌株与野生型USA300无明显差异。将示踪菌与DTZ、FUR和HFZ底物混合,肉眼均可观察到发光。不同浓度不同底物分析显示,USA300/Eno-Antares2/HFZ组成的系统发光性能最优,体外发光示踪的敏感性为50 CFU(菌落形成单位),小鼠体内示踪敏感性为100 CFU。结论金葡菌USA300/Eno-Antares2/HFZ示踪系统性能佳,可用于金葡菌感染、定植、播散等研究。

GraSR通过MurC促进金黄色葡萄球菌中等耐受万古霉素的作用研究

目的:探讨GraS(T136I)突变对万古霉素中等耐受金黄色葡萄球菌(vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus,VISA)耐药性的影响及机制。方法:采用同源重组技术将XN108(VISA)的GraS(T136I)突变位点引入到Newman(VSSA)构建突变菌株Newman-GraS(T136I),利用相同的方法在XN108中将突变位点进行回复,构建回复菌株XN108-GraS(I136T),利用E-test法测定各菌株对万古霉素的耐药性,通过透射电子显微镜观察各菌株细胞壁厚度,采用RT-qPCR检测了金葡菌细胞壁肽聚糖合成相关基因在XN108及其突变回复菌株XN108-GraS(I136T)中的表达水平变化,通过LacZ报告系统检测XN108和XN108-GraS(I136T)中murC基因启动子活性,通过结合位点分析和凝胶迁移阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)证实GraSR对murC基因的调控作用。结果:Newman-GraS(T136I)和XN108-GraS(I136T)替换菌株构建成功。回复株XN108-GraS(I136T)对万古霉素的MIC从原来的12μg/mL下降到8μg/mL,突变菌株Newman-GraS(T136I)对万古霉素的MIC从野生株的1.5μg/mL上升到4μg/mL。透射电子显微镜结果显示,XN108-GraS(I136T)的细胞壁(20.097±2.862) nm较野生株XN108(40.283±3.784) nm明显变薄(P=0.000)。通过RT-qPCR实验发现,金葡菌细胞壁肽聚糖合成相关基因murC、murD和mraY在回复菌株XN108-GraS(I136T)中表达下调(P=0.000),且murC的下降水平最多(约1.935倍),LacZ活性检测分析显示XN108中murC基因的启动子活性(2 182.333±104.580)明显强于其在XN108-GraS(I136T)(1 593.333±179.258)中的活性(P=0.008),结合位点检索分析及EMSA实验证实GraS激活的GraR具有直接结合murC基因调控区的功能。结论:金葡菌GraS(T136I)突变具有促进VISA的形成的作用,该作用可能是通过上调细胞壁合成关键基因murC的表达,导致细胞壁增厚来实现的。

2-型猪链球菌保护性抗原RfeA的B细胞表位预测

以2-型猪链球菌（SS2）保护性抗原RfeA推定的氨基酸序列为基础,采用Kyte-Doolittle法分析蛋白的亲水性,Emini法预测蛋白的表面可能性,以及Jameson-Wolf法预测蛋白的抗原指数;辅以Garnier-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schulz法对蛋白二级结构中柔性区域的分析,预测SS2保护性抗原RfeA的B细胞表位。结果表明,推测RfeA的B细胞表位位于RfeA蛋白N-端第21~27、53-60、104~117、140~160区域。用多参数预测SS2保护性抗原RfeA的B细胞表位,为实验研究SS2的多表位疫苗奠定基础。

脂蛋白SA2275抗体治疗金黄色葡萄球菌脑脓肿的实验初探

目的探讨脂蛋白特异性抗体通过血脑屏障及其在抑制金黄色葡萄球菌脑脓肿形成中的作用。方法利用大肠埃希菌表达并纯化重组金葡菌脂蛋白SA2275,制备特异性小鼠多克隆抗体(anti-SA2275)。制作金葡菌感染脑脓肿模型,利用ELISA法检测经腹腔注射的anti-SA2275在小鼠脑组织中的滴度,评估抗体通过血脑屏障的能力;再利用梯度稀释细菌计数法检测脑脓肿中的细菌载量,对脑脓肿进行连续病理切片检测脑脓肿的大小,评价抗体anti-SA2275治疗金葡菌脑脓肿的效果。结果成功获得高纯度SA2275重组蛋白;免疫小鼠获得anti-SA2275,效价为1:51200;anti-SA2275注射金葡菌脑脓肿模型小鼠后,在动物脑组织中检测到抗体的存在;治疗组小鼠脑脓肿大小和菌载量显著低于阴性对照组。结论在金葡菌感染小鼠所致的脑脓肿形成过程中,脂蛋白SA2275特异性抗体可以通过血脑屏障分布至脑组织,显著抑制脑脓肿的形成及细菌的定植,具有治疗金葡菌脑脓肿的应用前景。

WalK(S221P)突变影响万古霉素中等耐药金黄色葡萄球菌毒力的作用

目的探讨WalK(S221P)突变对万古霉素中等耐药金黄色葡萄球菌(vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus, VISA)毒力的影响及其机制。方法采用转录组测序比较VISA菌株XN108及其WalK(S221P)回复菌株K65的毒力基因表达差异,利用RT-qPCR检测菌株毒力基因的表达变化,溶血实验比较菌株的溶血能力。采用同源重组技术在金葡菌中引入WalK(S221P)突变,E-test检测菌株的耐药性。凝胶阻滞实验(EMSA)检测WalKR对靶基因调控区的结合能力。结果转录组测序结果显示,K65中多种重要毒力因子基因的表达上调(P<0.01),调控系统Agr的活性增强,溶血能力恢复。将WalK(S221P)突变引入USA300菌株后,其耐药性升高,毒力因子表达水平及溶血活性降低;EMSA证实WalKR对金葡菌Agr有直接调控作用;敲除agrA基因后,引入WalK(S221P)突变仍可使USA300agrA对万古霉素的耐药性升高,但毒力基因的表达水平及溶血活性改变不显著。结论 WalK(S221P)突变影响VISA毒力是通过Agr实现的,该突变导致WalKR的活性降低,激活Agr的能力下降,最终影响VISA菌株的毒力。

金黄色葡萄球菌RNAⅢ敲除株对γ-溶血素表达调控的影响

目的利用同源重组技术构建金黄色葡萄球菌Newman RNAⅢ基因敲除株,探究RNAⅢ敲除对金葡菌γ-溶血素表达调控的影响。方法分别扩增RNAⅢ基因的上下游同源臂,根据同源重组原理,构建pBT2基因敲除载体,利用同源重组技术,构建RNAⅢ敲除株。并对野生株和敲除株γ-溶血素的转录水平和蛋白水平进行研究。结果实时荧光定量PCR结果显示RNAⅢ敲除株γ-溶血素A/B/C亚基的转录水平较野生株显著降低, Western blot检测结果也显示敲除株γ-溶血素蛋白表达水平较野生株明显减少。结论 RNAⅢ敲除可显著影响金葡菌γ-溶血素的表达。

WalK(S221P)突变促进金黄色葡萄球菌荚膜产生的作用研究

目的探究WalK(S221P)突变促进金葡菌荚膜产生的作用及可能机制。方法采用转录组测序(RNA-seq)分析WalK(S221P)突变对金葡菌基因表达的影响,采用RT-qPCR检测荚膜合成基因的表达变化。利用荚膜染色和透射电镜观察确认WalK(S221P)突变促进金葡菌荚膜产生的作用,再用RT-qPCR筛选参与介导WalK(S221P)促进荚膜合成的调控分子,通过结合位点分析和凝胶迁移阻滞实验(EMSA)证实WalKR对目标分子的调控作用。结果RNA-seq分析显示WalK(S221P)突变对196个金葡菌基因的表达水平影响显著,其中16个荚膜合成操纵子基因在XN108中的表达均显著上调。RT-qPCR检测显示荚膜合成相关capA,capH和capK在含有WalK(S221P)突变的XN108及K-Newman菌株中分别较回复株XN108-R和野生型Newman菌株显著上调。荚膜染色和透射电镜观察显示XN108的荚膜合成相比于回复株XN108-R明显增多,增厚。RT-qPCR筛选提示WalK(S221P)促进金葡菌荚膜合成可能是通过上调MgrA表达水平实现的,结合位点检索分析及EMSA实验证实WalK激活的WalR具有直接结合mgrA基因调控区的功能。结论金葡菌WalK(S221P)突变具有促进金葡菌荚膜产生的作用,该作用的发挥可能通过上调MgrA的表达而实现。

负载锌离子的复合水凝胶对糖尿病小鼠全层皮肤缺损感染创面的作用及机制

目的探讨负载锌离子的复合水凝胶(以下简称含锌水凝胶)对糖尿病小鼠全层皮肤缺损感染创面的作用及其机制。方法该研究为实验研究。制备聚(甘油癸二酸酯)-共-聚乙二醇-共聚-邻苯二酚/季铵化壳聚糖水凝胶(以下简称单纯水凝胶)和在单纯水凝胶的基础上添加锌离子的疏松多孔且具有良好黏附性的固态含锌水凝胶。计算用磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡14 d后含锌水凝胶中锌离子的释放率。检测用单纯水凝胶、含锌水凝胶、PBS培养2 h后耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)浓度。利用酶标仪检测单纯水凝胶、含锌水凝胶、PBS对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)的清除率,反映清除氧自由基能力。测量用单纯水凝胶、含锌水凝胶、PBS培养24 h后人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形成的血管长度。采用细胞计数试剂盒8检测用单纯水凝胶、含锌水凝胶、PBS培养24 h后L929细胞的活力。将小鼠红细胞悬液分为用PBS处理的空白对照组和用相应溶液处理的单纯水凝胶组、含锌水凝胶组和Triton X-100组,利用酶标仪检测孵育2 h后红细胞的溶血情况并计算溶血率。以上实验样本数均为3。取21只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠,在背部脊柱对称位置各制备1个用MRSA感染的全层皮肤缺损创面。将小鼠分为滴加PBS的空白对照组和用相应水凝胶处理的单纯水凝胶组和含锌水凝胶组。伤后3 d,检测空白对照组、单纯水凝胶组、含锌水凝胶组小鼠创面中的细菌浓度,样本数为4。于伤后0(即刻)、3、7、14 d,大体观察小鼠创面感染情况并计算伤后3、7、14 d创面愈合率,样本数为5。伤后14 d,行苏木精-伊红染色和Masson染色分别检测小鼠创面中的新生上皮和胶原生成情况,行免疫荧光染色检测小鼠创面中血管新生及M2型巨噬细胞分布情况。结果浸泡14 d后,含锌水凝胶中锌离子的释放率为(70.5±4.6)%。与用含锌水凝胶比较,用PBS和单纯水凝胶培养2 h后细菌浓度均明显升高(P<0.05)。含锌水凝胶对DPPH的清除率明显高于PBS、单纯水凝胶(P值均<0.05)。与用PBS比较,用含锌水凝胶培养24 h后HUVEC形成的血管长度明显增长(P<0.05)。与用含锌水凝胶比较,用PBS和单纯水凝胶培养24 h后L929细胞的活力均明显降低(P<0.05)。孵育2 h后,与Triton X-100组相比,空白对照组、单纯水凝胶组、含锌水凝胶组红细胞的溶血率均显著降低(P<0.05);而后3组的红细胞溶血率相近(P>0.05)。伤后3 d,含锌水凝胶组小鼠创面中的细菌浓度明显低于空白对照组和单纯水凝胶组(P值均<0.05)。伤后3~14 d,3组小鼠创面均逐渐愈合,含锌水凝胶组小鼠伤后14 d创面基本愈合。伤后7 d,含锌水凝胶组小鼠创面愈合率为(72.4±8.4)%,明显高于空白对照组和单纯水凝胶组的(31.6±6.7)%、(44.7±5.4)%(P值均<0.05)。伤后14 d,含锌水凝胶组小鼠创面愈合率为(92.7±4.3)%,明显高于空白对照组的(73.5±7.4)%,P<0.05。伤后14 d,与空白对照组和单纯水凝胶组相比,含锌水凝胶组小鼠创面的新生表皮长度更长、厚度更厚,胶原沉积更多,新生血管和M2型巨噬细胞分布更丰富。结论含锌水凝胶具有良好的生物相容性、清除氧自由基能力和体内外抗菌效果、促血管生成能力,可持续缓释锌离子,促进创面再上皮化及胶原合成,从而促进小鼠全层皮肤缺损感染创面愈合。

铜绿假单胞菌必需基因的研究进展

铜绿假单胞菌为专性需氧非发酵革兰氏阴性杆菌,是医院感染的常见条件致病菌之一,可引起呼吸道、泌尿道、烧伤创面和菌血症等严重感染。铜绿假单胞菌耐药形势日益严峻,给临床治疗带来困难。必需基因是生长过程中必不可少的看家基因,对铜绿假单胞菌必需基因进行深入研究,不仅有助于了解细菌的生长、毒力等基本特性,也有助于筛选新的抗菌药物靶标。本文针对铜绿假单胞菌及其必需基因进行综述,首先介绍了铜绿假单胞菌的基本生理特性及目前耐药趋势,又归纳了必需基因的研究方法,最后对铜绿假单胞菌必需基因的研究进展进行总结。

乳酸乳球菌温敏水凝胶对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及其机制

目的探讨乳酸乳球菌温敏水凝胶对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及其机制。方法(1)按照菌与培养基体积比为1∶100用M17GS液体培养基培养约5×108集落形成单位/mL乳酸乳球菌(浓度下同),分别于培养0(即刻)、2、4、6、8、10、12 h用酶标仪观测其生长情况。另取该菌菌落同前处理并于相同时间点收集培养基分离细菌培养上清液,用台式pH计测定pH值,并用L-乳酸检测分析试剂盒测定培养0(即刻)、2、4、8、12 h的L-乳酸浓度(样本数为3)。(2)将泊洛沙姆温敏聚合物与M17GS液体培养基按照质量与体积比为0.2 g∶1 mL充分混匀,制备单纯温敏水凝胶。按照菌与水凝胶体积比1∶100在单纯温敏水凝胶中加入乳酸乳球菌,充分混匀后制备乳酸乳球菌温敏水凝胶,分别在4、37℃孵育以及成胶后再4℃孵育观察其形态;通过流变仪测定乳酸乳球菌温敏水凝胶在10~40℃的储能模量与损耗模量,同时观察成胶温度;将乳酸乳球菌温敏水凝胶冷冻干燥后,通过扫描电子显微镜观察其表面及其中乳酸乳球菌的形态结构。(3)将小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞用终质量浓度分别为100、10 ng/mL内毒素/脂多糖与γ干扰素培养24 h刺激M1型极化,将细胞分为空白对照组(不做其他处理)、乳酸乳球菌温敏水凝胶组和乳酸组。乳酸乳球菌温敏水凝胶组细胞加入1 mL乳酸乳球菌温敏水凝胶,乳酸组细胞加入终物质的量浓度为30 mmol/L乳酸,37℃培养24 h后,通过实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)法检测M2型巨噬细胞标志物精氨酸酶1、CD206的mRNA表达量(样本数为3),采用免疫荧光法检测精氨酸酶1和CD206的蛋白定位与表达。(4)取15只8~10周龄雌性BALB/c小鼠,通过链脲佐菌素联合高糖高脂饲料的方法诱导为糖尿病小鼠模型后,在每只小鼠背部制作直径6 mm全层皮肤缺损创面,采用随机数字表法将小鼠分为空白对照组(不做其他处理)、单纯温敏水凝胶组和乳酸乳球菌温敏水凝胶组,每组5只。水凝胶处理2组小鼠伤后即刻分别滴加200μL相应水凝胶至创面,每天更换水凝胶。水凝胶处理2组小鼠处理0(即刻)、3、6、9、12 d后,观察创面愈合情况,测量创面面积;处理12 d后,取创面组织,行苏木精-伊红染色观察肉芽组织厚度,采用免疫荧光法观测CD206、M1型巨噬细胞标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)阳性细胞。空白对照组小鼠于前述相同时间点进行相应观测。(5)取9只8~10周龄雌性BALB/c小鼠同实验(4)方法诱导糖尿病小鼠模型后,采用随机数字表法分为正常皮肤组(不做其他处理)、单纯创面组、乳酸乳球菌温敏水凝胶组,每组3只。单纯创面组与乳酸乳球菌温敏水凝胶组小鼠按照实验(4)方法制成全层皮肤缺损创面,前一组小鼠伤后不做其他处理,后一组小鼠伤后即刻滴加200μL乳酸乳球菌温敏水凝胶至创面。水凝胶处理组小鼠处理1 d后,取创面组织,通过实时荧光定量RT-PCR法检测白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和核因子κB mRNA表达量;眼球取血后,通过全自动血细胞分析仪检测外周血白细胞计数、淋巴细胞计数和单核细胞计数,通过L-乳酸检测分析试剂盒测定血清L-乳酸浓度。于前述相同时间点,取正常皮肤组小鼠相应部位正常皮肤组织、单纯创面组小鼠创面组织及2组小鼠血液进行相应检测。对数据行单因素方差分析、重复测量方差分析、Tukey和Dunnett检验。结果(1)乳酸乳球菌于培养约6 h生长达到平台期。乳酸乳球菌培养上清液中,pH值逐渐降低,至培养8 h下降至最低值4.9左右;L-乳酸浓度逐渐升高,至培养8 h达到最高值约70 mmol/L。(2)乳酸乳球菌温敏水凝胶在4℃为液体溶胶态,在37℃为固体凝胶态,成胶后于4℃孵育后再次变为液体溶胶态;成胶温度约为25℃,成胶后储能模量约为3000 Pa、损耗模量约为1000 Pa。扫描电子显微镜下可见,乳酸乳球菌温敏水凝胶为疏松三维多孔结构,乳酸乳球菌为椭球形并被包裹在水凝胶内部。(3)培养24 h,与空白对照组比较,乳酸乳球菌温敏水凝胶组、乳酸组巨噬细胞中精氨酸酶1表达量显著升高(q=11.620、15.250,P<0.01)、CD206 mRNA表达量显著升高(q=16.770、19.030,P<0.01),定位于细胞膜的CD206蛋白和定位于细胞质的精氨酸酶1蛋白表达明显升高;乳酸组巨噬细胞中精氨酸酶1、CD206 mRNA表达量与乳酸乳球菌温敏水凝胶组相近(q=3.629、2.259,P>0.05)。(4)处理3~12 d后,与空白对照组和单纯温敏水凝胶组比较,乳酸乳球菌温敏水凝胶组小鼠创面愈合速度更快,创面面积明显缩小,创缘炎症减轻。乳酸乳球菌温敏水凝胶组小鼠处理3、6、9、12 d后创面面积[(25.8±5.9)、(21.2±4.6)、(16.0±2.4)、(8.4±2.4)mm2]较空白对照组[(31.8±5.3)、(28.0±3.4)、(22.6±3.7)、(17.0±1.0)mm2]显著缩小(q=3.506、3.973、3.856、5.025,P<0.05或P<0.01),处理3、6 d后创面面积较单纯温敏水凝胶组显著缩小(q=3.739、3.739,P<0.05)。处理12 d后,与空白对照组和单纯温敏水凝胶组比较,乳酸乳球菌温敏水凝胶组小鼠创面肉芽组织更厚,创面组织中iNOS阳性细胞明显减少且CD206阳性细胞明显增多。(5)处理1 d后,单纯创面组小鼠创面组织中IL-1β、TNF-α和核因子κB mRNA表达量显著高于正常皮肤组小鼠正常皮肤组织(q=9.253、4.819、6.020,P<0.01),与乳酸乳球菌温敏水凝胶组相近(q=2.850、2.735、2.556,P>0.05);单纯创面组小鼠外周血白细胞计数、淋巴细胞计数与单核细胞计数显著高于正常皮肤组(q=3.523、5.373、5.279,P<0.05或P<0.01),与乳酸乳球菌温敏水凝胶组相近(q=0.621、1.240、1.293,P>0.05);3组小鼠血清L-乳酸浓度均保持在正常范围内且组间总体比较差异无统计学意义(F=4.095,P>0.05)。结论乳酸乳球菌温敏水凝胶在糖尿病全层皮肤缺损小鼠创面局部使用安全,能够通过原位生产投递乳酸,促进巨噬细胞从M1型向M2型极化,重塑创面愈合微环境,促进创面的高效愈合。