以小鼠精子/睾丸特异性抗原为基础的合成肽免疫避孕效应研究

目的 研制以精子 睾丸特异性抗原为基础的多价嵌合肽避孕疫苗。方法 选择小鼠精子 睾丸特异性抗原Sp17、Cy ritestin作为对象 ,采用分子设计的方法与外源性牛核糖核酸酶非选择性T细胞表位组合合成新型嵌合肽 3 5肽 ,并对其免疫效应进行研究。结果 该嵌合肽可刺激小鼠产生较高效价的血清和阴道粘膜特异性抗体 ,诱导脾脏淋巴细胞增殖 ,促进细胞因子IL 4的分泌 ;将其与佛氏佐剂混悬 ,免疫雌性BALB c小鼠可明显降低受孕率和每胎产仔率 ,其抗血清可显著抑制体外精 卵结合和融合。结论 新型嵌合肽具有较明确的抗生育作用 ,提示以分子设计、蛋白质优化方案进行多价避孕疫苗的研究是可行的。

浅谈免疫学专业研究生基础科研能力培养

我国研究生教育是导师负责制,以培养学生的科研思维为主要目标,并且在科研工作开展时系统地对相关实验能力进行培养。但目前很多高校都在进行研究生扩招的情况下,导师很难"手把手"的培养众多的研究生,科研一线的青年工作者,就担负起了研究团队中培养研究生基础科研能力的责任,本文主要结合笔者自身的经验,探讨如何有效地做好研究生基础科研能力的培养工作。

深化医学免疫学实验教学改革的探讨

医学免疫学是一门重要的基础医学课程，作为生命科学的前沿学科，与基础医学以及临床医学的各个学科相互交叉和渗透，是沟通基础医学和临床医学的重要桥梁。同时，免疫学作为一门实验学科，其知识更新迅速，且理论知识密切联系实际应用。因此，医学免疫学教学不仅要培养学生对免疫学理论的认知能力，更重要的是培养学生严谨的逻辑思维能力及独立的实践操作能力。这就要求我们教学过程中不仅要重视理论教学，同时要加强实践教学［1］，即免疫学实验教学。医学免疫学实验通过实验教学环节，巩固学生对免疫学知识的理解和掌握程度，同时培养学生严谨的科学态度以及分析问题和解决问题的能力。实验教学的质量直接影响学生对免疫学基本理论的认知能力和实践应用能力。

HBV新型免疫原的设计、合成及免疫原性研究

目的 探讨如何将表位构建成有效免疫原。方法 以Pre S( 2 ) 蛋白两优势性B细胞表位和HBcAg两Th细胞表位为基础 ,设计、合成了 2种MAP多肽 ,以此两MAP肽为免疫原免疫兔和小鼠 ,观察体液免疫反应。结果 此两种MAP多肽均比Pre S( 2 ) 蛋白诱发更高抗体滴度 ;Th细胞表位引入可显著增强反应强度。结论 增加肽抗原结构复杂性可提高其免疫原性 ,其表位排列以B细胞表位在赖氨酸核心外侧为佳 。

基于HBV核心抗原CTL表位的治疗性多肽在体诱导抗原特异性细胞免疫应答的研究

目的 探讨基于表位的治疗性多肽抗原组分、结构与诱导免疫应答之间的关系。方法 用分子设计的理论和方法 ,设计基于HBV抗原免疫优势性CTL、Th及B细胞表位的 3种治疗性多肽候选疫苗分子 ,经Merrifield固相多肽合成技术合成 ,并经HPLC纯化、鉴定。以BALB c(H 2 d)纯系小鼠为实验对象 ,进行体内免疫学功能研究。结果 所设计治疗性多肽分子可在体诱导较强的抗原特异性CTL应答和适度的抗体反应。Th、B细胞表位的引入可增强CTL表位肽的效应。结论 提示在治疗性表位多肽疫苗的分子设计中 ,引入B -、Th表位可显著提高CTL表位肽的免疫原性。

乙型肝炎病毒HBcAg免疫优势CTL表位多肽在HBV转基因小鼠体内的免疫学功能研究

目的 探讨基于乙型肝炎 (Hepatitisbvirus,HBV)核心抗原免疫优势细胞毒性T淋巴细胞 (CytotoxicTlympho cyte,CTL)表位的治疗性多肽抗原组分、结构以及在HBV转基因小鼠体内的免疫学功能。方法 用分子设计的理论和方法 ,设计基于HBV核心抗原免疫优势性CTL表位、Pre S2B细胞表位及破伤风类毒素通用TH 表位的治疗性多肽疫苗候选分子 ,经Merrifield固相多肽合成技术合成 ,经高效液相色谱 (HPLC)纯化、鉴定。以HBV转基因小鼠为试验对象 ,进行体内免疫学功能研究。结果 所设计治疗性多肽分子可在体诱导较强的抗原特异性CD8+ T细胞应答和适度的抗体反应 ,并抑制HBV特异性抗原的分泌和乙型肝炎病毒复制。结论 提示所设计基于HBV核心抗原免疫优势性CTL表位、Pre S2B细胞表位及破伤风类毒素通用TH 表位的多肽分子可作为乙型肝炎治疗性多肽疫苗候选分子。

免疫磁珠法分离人外周血CD4^+ CD25^+调节性T细胞

目的建立人外周血单个核细胞中CD4+CD25+调节性T细胞(regulatery T cells,Treg)免疫磁性细胞分离方法(megnetic activated cell sorting,MACS),并鉴定其分离效率。方法采用免疫磁珠两步法(即阴性分选和阳性分选2步)分离人外周血单个核细胞中的CD4+CD25+调节性T细胞,首先采用生物素标记的鸡尾酒抗体和抗生物素标记的磁珠阴性分选CD4+T细胞,再用抗CD25+的磁珠阳性分选CD4+CD25+T细胞。分离后的细胞经抗体染色后再通过流式细胞仪检测其分离纯度;胞内因子染色检测其转录因子FOXP3的表达频率;台盼蓝染色检测细胞的存活率;3H-TdR掺入法检测其对CD4+CD25-T细胞增殖抑制效应。结果阴性分选CD4+T细胞的纯度为(92.2±1.7)%,阳性分选后CD4+CD25+Treg细胞的纯度为(95.1±1.2)%。胞内因子染色FOXP3在CD4+CD25+Treg细胞中的表达率为(80.4±1.2)%,台盼蓝染色细胞存活率为(95.6±3.3)%3。H-TdR掺入法检测其对CD4+CD25-T细胞具有明显的抑制作用。结论采用免疫磁性细胞分离技术能够高效、快速地得到一群纯度高并且细胞活力好的CD4+CD25+Treg,为进一步研究其功能提供了方便。

人源轮状病毒转基因马铃薯口服免疫小鼠的免疫应答研究

目的分析人源轮状病毒转基因植物抗原的口服免疫应答反应。方法在根癌脓杆菌介导获得系列转基因马铃薯植株的基础上,用ELISA分析转基因马铃薯中目的蛋白表达水平。马铃薯块茎直接口服免疫Balb/c小鼠,ELISA分析免疫小鼠血清、唾液、粪便提取物特异抗体水平。结果获得一株最高表达量的转化株;口服免疫可诱导较强的血清IgG反应和强烈的黏膜sIgA反应,粪便的sIgA最高,唾液次之,尿液中无sIgA;加霍乱毒素B亚单位(CTB)佐剂免疫组小鼠和霍乱毒素(CT)佐剂免疫组小鼠抗体水平无显著差异,无佐剂免疫组小鼠抗体水平略低。结论人源轮状病毒转基因植物疫苗联合黏膜佐剂免疫动物可诱导特异的系统与黏膜免疫应答,且黏膜免疫强度略高于系统免疫。

IL-12对小鼠肥大细胞瘤基因疫苗的免疫学作用

目的 研究小鼠肥大细胞瘤P815基因疫苗和鼠IL 12对该疫苗的免疫学作用。方法 将小鼠肥大细胞瘤P815特异抗原基因P1A克隆到真核表达质粒pCI neo中 ;用P815细胞对DBA/ 2小鼠右腹侧皮下注射 ,构建P815小鼠肿瘤模型 ;以重组基因疫苗单独或与鼠IL 12真核表达质粒一起肌肉注射 ,观察肿瘤的消长、特异细胞毒T淋巴细胞激活和抗体的生成情况。结果 重组基因疫苗在体外有很好的表达 ,注射后CTL的杀伤效率为 4 0 % ,IL 12共注射的CTL杀伤效率达到 6 0 %。免疫后 ,30 %小鼠的肿瘤出现消退 ;同IL 12共注射则有 5 0 %的小鼠的肿瘤出现消退。 2种情况下都不能检测到任何特异抗体的产生。结论 重组P1A肿瘤疫苗能有效激活机体的肿瘤特异免疫应答 ;基因疫苗对小鼠P815肿瘤的治疗作用主要归因于细胞免疫 ;IL 12有增强这种免疫应答的作用。

穿膜肽HIV-Tat_(49-57)和CTL表位融合多肽疫苗的初步免疫学效应研究

目的 探讨穿膜肽HIV Tat4 9- 57将CTL表位带入活细胞胞质并将其投入MHC Ⅰ类抗原提呈途径的可能性。方法 应用多肽固相合成技术 ,分别合成含HIVTat4 9- 57和HLA A2 1限制性CTL优势表位MART 12 7- 35的 18肽和该CTL表位 9肽。采用间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜技术 ,分别对上述 18肽和 9肽的穿膜能力进行了动态观察。进一步用标准51 Gr释放试验分别检测了上述 18肽和 9肽在HLA A2 1阳性健康者外周血单个核细胞 (PBMC)中诱导的表位MART 12 7- 35特异性CTL活性。结果 18肽能够穿过活哺乳动物细胞质膜进入胞质 ,并呈现出时间、剂量依赖关系 ;而 9肽则无此效应。与 9肽相比 ,18肽在体外诱导出了明显增强的特异性CTL活性 (P <0 0 5 )。结论 穿膜肽HIVTat4 9- 57可有效携带CTL表位穿过细胞膜进入胞质 ,并有效激发出针对该表位的特异性CTL应答 。

颗粒性肽-DNA复合疫苗抗肿瘤免疫的研究

诱导有效的抗肿瘤免疫应答是肿瘤免疫治疗的主要目标 ,由于肽疫苗和DNA疫苗具备较高的安全性和实用性 ,因而成为肿瘤疫苗学领域中发展最为迅速的肿瘤免疫治疗方案之一。但是这两种疫苗形式仍然具有各自的缺点 ,其抗原呈递动力学存在显著差异 ,提示这两种疫苗可能存在互补性。本研究对多肽疫苗和DNA疫苗进行综合 ,设计出新型肽 DNA复合疫苗 ,并以P815A为模式抗原 。

乙肝治疗性多肽免疫刺激复合物的制备及鉴定

目的 为有效提高小分子多肽在体诱导CTL应答的能力 ,制备了乙肝治疗性多肽免疫刺激复合物 (ISCOMs) ,并对其形成进行了鉴定。方法 乙肝治疗性多肽ISCOMs采用透析法制备获得 ,并经小分子多肽的SDS PAGE电泳法确定了复合物中小分子多肽的存在 ,采用Bradfords法测定了复合物中多肽的结合量。结果 在电镜下呈典型的蜂巢状亚微型颗粒结构 ,所制备的ISCOMs中多肽的结合量约为 0 .30mg/ml。结论 ISCOMs的成功制备 。

肝素酶CTL表位负载的树突状细胞疫苗体外抗肿瘤免疫效应研究

目的研究肝素酶(Hpa)多肽疫苗体外能否诱发肝素酶特异性CTL反应,为肝素酶多肽疫苗的临床应用提供理论依据。方法5条HLA-A2限制性肝素酶抗原表位[Hpa(525-533)(PAFSYSFFV)、Hpa(353-361)(PLLSDTFAA)、Hpa(277-285)(KMLKSFLKA)、Hpa(400-408)(PLPDYWLSL)、Hpa(405-413)(WLSLLFKKL)]分别负载正常人外周血来源(PBMC)的树突状细胞(DC),诱导肝素酶特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL),采用4 h标准51Cr释放实验检测上述CTL对不同肿瘤细胞的免疫杀伤效应,采用ELISPOT方法检测肝素酶表位肽负载的DC疫苗刺激的效应细胞IFN-γ的释放。结果5条肝素酶多肽表位中,只有Hpa(525-533)、Hpa(277-285)和Hpa(405-413)体外可以诱导肝素酶表位特异性CTL反应,对Hpa阳性且HLA-A2阳性的KATO-Ⅲ胃癌细胞、U2OS骨肉瘤细胞、SW480结肠癌细胞具有明显的杀伤效应,对HLA-A2阴性的HepG2肝癌细胞和Hpa阴性的MCF-7乳腺癌细胞不具有杀伤效应,但对转染了HLA-A2的HepG2细胞和转染了肝素酶质粒的MCF-7细胞恢复杀伤效应,对自体淋巴细胞不具有杀伤效应,进一步研究表明,Hpa(525-533)、Hpa(277-285)和Hpa(405-413)表位肽可以促进CTL细胞IFN-γ的释放。结论人肝素酶特异性抗原表位Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)不仅能激发机体特异性的抗肿瘤效应,而且还能诱导一个非特异性抗肿瘤的良性循环,这种肝素酶多肽疫苗具有广谱、高效、特异、安全的优点,为肝素酶表位多肽疫苗的临床应用提供了理论依据。

小鼠精子Sp17与IL-5融合蛋白的构建、表达及其免疫原性鉴定

目的构建和表达小鼠精子蛋白Sp17与白介素5(IL-5)融合蛋白,并对其进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR技术从质粒pGEM-1-IL-5中扩增IL-5基因片段,将其克隆至pET/Sp17原核表达载体中与Sp17基因融合,构建重组质粒pET/Sp17-IL-5,经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni2+-NTAAgarose纯化,SDS-PAGE检测、N端测序及Western blot;重组蛋白Sp17-IL-5免疫小鼠后ELISA检测小鼠血清特异性抗体。结果成功构建小鼠精子蛋白Sp17与IL-5融合蛋白的高效表达质粒pET/Sp17-IL-5,重组工程菌pET-28a(+)-Sp17-IL-5/BL21经IPTG诱导目的蛋白表达率约28%,PAGE初步测定目的蛋白相对分子量(Mr)约39000,纯化后蛋白纯度达91%,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体。结论Sp17-IL-5蛋白经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫活性,为新型Sp17避孕疫苗的研制奠定基础。

非洲爪蟾TGF-β5和小鼠TRP-2联合免疫诱导抗原特异性CTLs

目的 研究非洲爪蟾转化生长因子 β5 (aTGF β5 )基因免疫是否能增强肿瘤治疗性DNA疫苗诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的能力。方法 构建编码小鼠肿瘤抗原酪氨酸酶相关蛋白 2 (mTRP 2 )的真核表达质粒 ,与aTGF β5真核表达质粒联合免疫C5 6BL 6小鼠 ,采用标准51 Cr释放试验检测抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的诱导。结果 aTGF β5和mTRP 2联合免疫可在体外诱导H 2Kb 限制的mTRP 2 aa1 80 - 1 88特异性细胞毒性T淋巴细胞产生。结论 aTGF

FOXP3在调节免疫应答中的作用

调节性T细胞以反式作用方式调控免疫应答。Tregs的抑制功能极大程度上依赖于高水平和稳定的转录因子FOXP3的表达,它与其它转录因子一起活化抗炎基因和抑制促炎基因的表达。FOXP3对Tregs中独特的信号机制的形成是必需的,其可以形成一个正反馈通路促进其自身的表达。此外,FOXP3启动一个复杂的转录调节网络以稳定Treg表型。最新数据显示FOXP3的这些功能需要许多传统T细胞相关的转录因子协同作用。在本综述中,我们将讨论FOXP3的结构特点以及如何通过与其它转录因子相互作用而发挥功能,FOXP3在Tregs独特信号级联反应中的作用,FOXP3和其他T细胞转录因子的协同作用,以及Treg细胞可塑性的分子机制。

免疫组化及原位杂交检测人肺组织中的C5a受体

目的 检测正常人肺组织细胞上C5aR的表达和分布 ,阐明急性肺损伤、ARDS等病理发生过程中C5aR可能的作用。方法 以小鼠抗人C5aR短肽单克隆抗体作为检测抗体 ,对人肺组织细胞作免疫组织化学ABC染色 ;pUC1 9 C5aR质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切 ,得到 91 0bp的片段 ,地高辛标记制作原位杂交的探针 ,对肺血管内皮细胞作原位杂交检测。结果 发现肺血管内皮细胞有C5aRmRNA。肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、肺泡平滑肌细胞、血管内皮细胞以及巨噬细胞上均有C5aR表达。结论 C5a作为前炎症因子 ,与肺组织细胞上C5aR作用后 ,可能会介导急性肺损伤、ARDS等疾病的发生 ,说明这些疾病可能与C5a有关。

小鼠精子蛋白Sp17的克隆、表达及其免疫原性研究

目的获得鼠精子蛋白Sp17基因,构建重组表达载体并实现其在大肠杆菌中的高效表达,为制备免疫性避孕疫苗奠定基础。方法提取BALB/c小鼠睾丸组织总RNA,通过RT-PCR扩增Sp17基因全长cDNA序列,并将其克隆至pMD 18-T质粒载体中,再经HindⅢ/XhoⅠ双酶切将Sp17基因片段亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot对表达产物进行初步鉴定,并检测重组蛋白Sp17免疫小鼠后血清特异抗体滴度。结果获得了小鼠Sp17的全长cDNA,成功构建了重组原核表达载体pET/Sp17,在IPTG的诱导下实现了目的蛋白在大肠杆菌中的高效表达,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体。结论小鼠精子蛋白Sp17基因序列已被克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效、正确的表达,重组蛋白Sp17能够诱导产生特异性免疫反应,具有一定程度的免疫原性。

肿瘤抗原MAGE-2多抗原肽疫苗的设计合成及免疫原性研究

目的 采用多抗原肽 (multipleantigenpeptide ,MAP)设计方案 ,提高线性短肽的免疫原性。方法 对肿瘤抗原MAGE 2 2 2 0 2 2 8细胞毒性T细胞 (cytotoxicTlymphocyte ,CTL)表位进行分子修饰 ,设计、合成四分支多抗原肽 (MAP4)。标准Fmoc合成方案进行合成 ,液相色谱 质谱联用 (LC MS)进行目的肽鉴定。以体外刺激人外周血单核细胞 (PBMC)诱导CTL效应及IFN γ分泌 ,标准 51 Cr释放实验与Elispot实验进行免疫原性的研究。结果 标经准 51 Cr释放实验验证 ,低浓度的MAP4可以诱导出有效的CTL效应 ,Elispot实验显示MAP4能够有效诱导的IFN γ分泌。结论 MAP的构建能够增强CTL效应和IFN γ的分泌 。

O-糖基化HBVPre-S_(2)CTL表位分子模建及免疫学活性研究

目的 研究O 糖基化 (Glycosylation)修饰对HBVPre S( 2 ) 上CTL表位结构及其免疫学活性的影响。方法 选择HBVPre S( 2 ) 上公认的HLA A2限制性CTL表位 44～ 5 3(SILSKTGDPV) ,以Ser44为糖基化位点 ,进行计算机分子模建 ,并利用糖肽合成技术 ,固相合成α GalNAc糖基化CTL表位 ,免疫BALB/c(H 2Db)小鼠 ,观察其诱导CTL活性。结果 α GalNAc 糖基化可改变表位形态使之更适宜与HLA A2类分子结合 ,糖基部分基团可从HLA A2结合沟中向外伸出。与对照组比Ser44α D GalNAcO 糖基化 44～ 5 3肽 ,诱导出较强的针对经抗原预刺激P815细胞的CTL应答 ,特别是 5 0 μg和 5 0 0 μg组 ,而且有明显的剂量 效应关系。 结论 Ser44α D GalNAc 糖基化修饰能改变Pre S( 2 ) 上CTL表位 44～ 5 3的结构 ,并促进特异性CTL应答 。