人肿瘤坏死因子α基因cDNA直接注入小鼠骨骼肌表达的初步研究

本实验将带有人肿瘤坏死因子。基因（ＴＮＦ－α基因）ｃＤＮＡ的重组表达质粒直接注入小鼠骨骼肌内，观察了外源基因在小鼠体内的表达情况。双抗体夹心法ＥＬＩＳＡ法显示，实验组小鼠肌注１５ｄ后血浆中ＴＮＦ蛋白含量逐渐增高并达高峰，然后开始下降。ＲＮＡｄｏｔｂｌｏｔ结果显示，肌注２０ｄ时实验组中ＥＬＩＳＡ阳性的小鼠，其肌注处肌肉组织有ＴＮＦ－α基因表达。由此表明，直接将外源ＤＮＡ导入骨骼肌细胞内是基因转移的又一新途径。

人凝血因子Ⅸ基因（pKG_5－Ⅸ）直接注入小鼠骨骼肌中瞬间表达的研究

我们将带凝血Ⅸ因子基因ｃＤＮＡ的ｐＫＧ_５－Ⅸ裸ＤＮＡ直接注入小鼠骨骼肌内，注射后第１４天取小鼠血分离血清进行研究。结果显示：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析中能清晰地看到一与凝血因子ⅨｃＤＮＡ表达相关的特定蛋白带，进一步的实验ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ、ＥＬＩＳＡ及一期法有力地证实了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果，人ＦⅨ基因转移小鼠出现５５ｋＤ特异带与人ＦⅨ相符，即证明它确系人ＦⅨ。

人脐静脉内皮细胞表达CD137分子及其功能的初步研究

目的 了解人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)CD137分子的表达情况 ,探讨其对内皮细胞功能的影响。方法 胰蛋白酶法分离培养人脐静脉内皮细胞 ,用RT PCR、定量荧光PCR和流式细胞仪技术 ,分别观测未刺激和用内毒素 (LPS)刺激的内皮细胞CD137mRNA与蛋白的表达情况。用anti CD137单克隆抗体交联内皮细胞表面CD137,ELISA检测其上清液中IL 8的含量。结果 ①RT PCR和实时荧光定量RT PCR结果显示 ,未经刺激的人脐静脉内皮细胞表达少量CD137mRNA ,流式细胞仪检测证实其细胞表面表达少量CD137蛋白 ;当用LPS刺激内皮细胞培养 2 4h后 ,mRNA和蛋白表达量均显著提高。②ELISA检测发现 ,anti CD137单克隆抗体交联内皮细胞表面CD137分子后 ,和同型抗体对照组相比 ,其培养上清液中细胞因子IL 8的表达量明显提高 ,与LPS刺激内皮细胞上调IL 8表达的程度相当。结论 人脐静脉内皮细胞组成性表达少量CD137分子 ,LPS可以显著上调其表达。交联内皮细胞表面CD137分子可提高其IL 8产生和分泌 。

缺氧/辐射双敏感性启动子的构建及其转录调控特性

目的 :构建缺氧 /辐射双敏感性启动子 ,阐明其转录调控特性 .方法 :通过基因重组将缺氧反应元件 (HREs)序列插入早期生长反应基因 1 (Egr 1 )启动子的上游 ,构成缺氧 /辐射双敏感性HRE Egr启动子及其报告载体pHEL ,转染肺癌A5 4 9细胞 .在 2 ,4 ,6 ,8,1 0Gy照射 (γ 射线 )后及合并缺氧(氧浓度 1 ,5 ,1 0 ,2 5 ,5 0mL/L)时 ,检测转染细胞内报告基因荧光素酶 (luciferase ,Luc)表达活性 ,以及在 6Gy照射合并氧浓度 1 0mL/L时Luc表达的动态变化 .结果 :成功构建了HRE Egr启动子及其报告载体 ,转染A5 4 9细胞 ,发现常氧下HRE Egr启动子照射后表达活性迅速升高 ,呈辐射剂量依赖性 ,与Egr 1启动子相一致 .缺氧时 ,Egr 1启动子辐射诱导活性明显下降 (P <0 .0 5 ) ,而HRE Egr启动子活性则显著升高(P <0 .0 1 ) ,同时后者活性持续时间 (32h)明显长于前者 (1 6h) .结论 :HRE Egr启动子具有辐射 /缺氧双重敏感性 。

实时荧光定量检测中国实验用小型猪肝脏CYP3A29 mRNA表达水平

CYP3A29是猪肝脏最重要的药物代谢关键酶。研究中国实验用小型猪肝脏CYP3A29mRNA的表达特性对于评估其是否适宜于作为人CYP3A4介导的药理学研究动物模型具有一定意义。以β-actin作校正,利用TaqMan定量技术对巴马香猪、贵州小型香猪肝脏CYP3A29mRNA表达水平进行检测,并以荣昌猪作为对照。结果表明,巴马香猪、贵州小型香猪、荣昌猪肝脏CYP3A29mRNA表达水平与报道的人肝脏CYP3A4相近;三品系(种)猪间肝脏CYP3A29mRNA表达水平较为接近,但品系(种)内个体间变异较大。提示巴马香猪、贵州小型香猪作为药物评价的实验动物具有一定可行性。

斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因pET22b载体的构建及表达

目的构建含斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因片段的pET22b(+)表达载体,利用SDSPAGE和免疫印迹分析阳性克隆菌株的诱导表达及其表达产物的免疫原性。方法提取斯氏狸殖吸虫成虫总RNA,经RTPCR扩增及T/A克隆后测定其核苷酸序列并进行序列查询与比对。根据已获得的序列和pET22b(+)载体的内切酶位点信息设计引物并再次进行T/A克隆,阳性克隆质粒经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后将目的片段与pET22b(+)载体连接并转化至BL21(DE3)菌株,收集经IPTG诱导表达后的菌液进行SDSPAGE和免疫印迹分析。结果SDSPAGE显示,经诱导表达的阳性克隆菌株、未经诱导菌株与空载体菌株之间的蛋白带型未见明显差异,但经诱导表达的阳性克隆菌株的22ku蛋白条带比另两菌株明显,免疫印迹证实,该蛋白条带可与斯氏狸殖吸虫成虫ES抗原免疫豚鼠血清发生强阳性反应。结论成功构建了含斯氏狸殖吸虫成虫半胱氨酸蛋白酶基因的pET22b(+)载体,经诱导表达的融合蛋白能与斯氏狸殖吸虫成虫ES抗原免疫豚鼠血清发生较强的免疫反应。

重组LIGHT-Fc基因对食管鳞癌Eca109细胞生长的抑制

目的研究重组LIGHT—Fc基因对食管鳞癌Eca109细胞的抑制效应。方法以脂质体介导LIGHT—Fc基因转染食管鳞癌Eca109细胞，观察基因转染后对Eca109细胞体外生长的影响。建立荷瘤裸小鼠模型，分为野生型组（Eca109／Wt）、转空质粒组（Eca109／neo）和实验组（Eca109／LIGHT），每组15只。观察各组成瘤情况和瘤组织的病理表现。结果Eca109细胞中有LIGHT受体的表达，转染LIGHT—Fc基因后，瘤细胞的生长被抑制。野生型组、转空质粒组和实验组成瘤分别为12、11和5只，实验组与其余两组比较差异有统计学意义（X^2=6．652，4．821，P〈0．05）。病理检查显示在实验组小鼠瘤组织中存在较为明显的坏死。结论LIGHT—Fc基因的表达对食管鳞癌Eca109细胞具有体内和体外抑制作用。