组织工程皮肤分泌细胞因子的初步研究

目的 研究组织工程皮肤培养液中IL 1β、IL 6和IL 8的分泌情况。方法 收集组织工程皮肤制备过程中单层成纤维细胞(fibroblast ,FB)培养液、胶原凝胶真皮替代物(dermalequivalent,DE)、复合壳多糖DE和复合壳多糖皮肤替代物(skinequivalent,SE)培养液标本,ELISA法检测其中IL 1β、IL 6和IL 8分泌量。结果 复合壳多糖真皮基质促进FB、角质形成细胞(keratinocyteKC)分泌IL 6、IL 8。SE分泌的IL 6、IL 8在DE加KC之后和SE形成分层表皮时形成两个高峰。结论 FB、KC在壳多糖组织工程皮肤中混合器官型培养时分泌IL 6和IL 8较明显,这些细胞因子可在创面愈合中发挥重要作用。

复方壳多糖组织工程皮肤分泌b-FGF的初步研究

目的研究组织工程皮肤培养液中碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)的分泌情况。方法收集复方壳多糖组织工程皮肤制备过程中复方壳多糖皮肤替代物(SE)、复方壳多糖真皮替代物(DE)、单层角质形成细胞(KC)以及复方壳多糖DE与KC在transwell内共培养的培养液样本,双抗体夹心ELISA法测定其中b-FGF分泌量。结果b-FGF分泌量依次为单层KC<复方壳多糖DE/KC共培养<复方壳多糖SE<复方壳多糖DE。结论角质形成细胞能调控成纤维细胞分泌b-FGF能力,有利于伤口愈合。

基于准静态平面流场的新型皮肤组织工程灌注式生物反应室设计与初步模拟

目的设计准静态平面流场的灌注式新型生物反应器,以适合组织工程皮肤的培养要求。方法采用计算流体动力学(computational fluid dynamics,CFD)商业软件FLUENT模拟新型生物反应器中的流场及培养支架壁面上的切应力,设计出一种能够层叠、低剪切力、均匀平面流场的生物反应器。结果模拟结果表明筛网状支撑物及组织工程皮肤构建物表面处的最大切应力小于3×10-5N/cm2,且培养室中的流场是均匀的。结论新型生物反应器满足准静态平面流场的要求,有可能在未来的皮肤组织工程研究和生产中广泛使用。

人毛囊细胞来源双层皮肤替代物的构建和组织学特征

目的探索人毛囊细胞构建的双层皮肤替代物的组织学特征。方法用毛乳头细胞、真皮鞘细胞分别与外根鞘细胞构建复合壳多糖双层皮肤替代物,分析其体外和移植至大白鼠后的组织学特征。结果毛囊来源细胞构建的皮肤替代物中表皮细胞排列更紧密、角化突出,真皮内可见与表皮相连的上皮细胞柱及球形膨大细胞团形成。结论毛囊细胞是构建皮肤替代物的良好细胞来源。

不同代次角质形成细胞构建组织工程皮肤的增殖分化能力比较

目的比较三维条件下不同代次角质形成细胞构建的表皮形态及增殖分化情况。方法采用不同代次角质形成细胞构建组织工程皮肤，通过苏木精-伊红（HE）和高碘酸-希夫（PAS）染色，观察各组组织工程皮肤的结构形态；并利用角蛋白CK1／CK10、CK5／CK14、细胞增殖核抗原Ki-67免疫组织化学染色，比较各组组织工程皮肤表皮的增殖分化能力。结果不同代次角质形成细胞构建的组织工程皮肤都有明显的表皮真皮结构。1、2代较其他代次分层情况好，2代表皮层厚度明显高于其他代次（P〈0．05）。加Ⅳ型胶原组的表皮真皮间黏附的紧密程度高于未加Ⅳ型胶原组，Ⅳ型胶原对表皮的厚度影响不大（P〉0．05）。Ⅳ型胶原组PAS染色阴性，说明单独加Ⅳ型胶原不能形成基底膜结构。2代角质形成细胞Ki-67增殖系数接近正常皮肤，其余各代次角质形成细胞的增殖系数逐渐减少（P〈0．05）。CK1／CK10、CK5／CK14在1、2代皮肤中阳性表达明显，其余代次对于两种角蛋白的表达并不明显。结论3代以前角质形成细胞有更好的增殖分化能力，更适合作为组织工程皮肤的种子细胞。

表皮真皮分离方法的探索

目的 探索一种适合细胞培养的分离真表皮的酶消化法。方法 将分离酶配成 0 1%、0 2 %、0 5 % 3个浓度 ,在 4℃或 3 7℃条件下消化头皮或包皮 ,摸索消化的时间 ,并与 0 2 5 %胰蛋白酶消化法进行对比。结果 0 5 %分离酶在 4℃条件下消化 16～ 18h ,或 3 7℃条件下消化 1h ,能够很好地分离表皮与真皮 ,再用胰蛋白酶将表皮游离成角质形成细胞 ,活细胞率高 ,培养后细胞融合时间短。结论 分离酶能够选择性消化基底膜成分而起到很好的分离表皮与真皮的作用 ,分离酶和胰蛋白酶联合消化法是一种非常理想的分离角质形成细胞的方法 ,同时又能够避免成纤维细胞的污染。

三维培养汗腺腺上皮细胞形成汗腺样结构的初步研究

目的探索体外构建人外泌汗腺样结构的方法。方法取自愿捐献的正常腋部全层皮肤,分离培养汗腺腺上皮细胞,倒置相差显微镜下观察。将汗腺腺上皮细胞以2×105个/cm2密度接种至Matrigel凝胶下(A组)、凝胶上(B组)、凝胶中(C组),进行三维立体培养,激光扫描共聚焦显微镜、HE染色及免疫组织化学染色观察有无汗腺样结构形成。结果原代汗腺分泌部上皮细胞接种后24 h可见细胞贴壁,贴壁细胞呈梭形,2～3 d后细胞呈多克隆麦粒样生长,14 d后细胞融合呈铺路石样生长,融合后的汗腺腺上皮细胞呈扁平多角形,中间有较大圆形核;第1代细胞形态与原代极为相似;第2代细胞形态不规则,多数伸出长伪足;第3代细胞多呈星形状,细胞体积大,与邻近细胞相互融合。A组汗腺腺上皮细胞三维立体培养11 d形成管腔结构;B组汗腺腺上皮细胞立体培养8 h,细胞胞浆伸长呈丝状,与邻近细胞相连呈管腔或半管腔形,但细胞增殖不明显;C组汗腺腺上皮细胞三维立体培养2～3 d,细胞分裂增生,增生细胞彼此紧密排列成管腔结构,中间可见明显腔隙,随新生细胞增多,管腔结构逐渐演变为不规则球形结构。激光扫描共聚焦显微镜观察示C组形成球形结构,细胞团中央有管腔结构;球形结构HE染色示为管腔结构,免疫组织化学染色示角蛋白18、癌胚抗原表达阳性,与汗腺分泌部管状结构极为相似。结论汗腺腺上皮细胞在Matrigel凝胶中三维立体培养可形成汗腺样结构。

外源性人端粒酶逆转录酶基因转染对正常人毛乳头细胞的影响

目的研究外源性人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因转染对体外培养正常人毛乳头细胞的影响。方法采用脂质体转染法,将hTERT基因导入体外培养的正常人毛乳头细胞,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养。检测转染细胞内hTERT基因的整合和表达情况,初步分析转染细胞的生物学特性。结果转染后获得1个阳性细胞克隆,扩大培养后细胞生长良好,传代次数增加,已连续传至35代。检测证实转染细胞内hTERT基因在DNA、mRNA和蛋白质水平均有表达,且此转染细胞具有体外培养正常毛乳头细胞的生物学特性。结论外源性hTERT基因转染可以延长体外培养正常人毛乳头细胞的寿命且可保持其正常的生物学特性。

人原代表皮干细胞及其传代细胞生物学特性的比较

目的比较体外培养条件下人原代表皮干细胞与传代细胞的生物学差异。方法选择2009年5-12月在我科医学美容门诊行包皮环切术后的包皮标本共20例,从包皮标本获得人原代表皮干细胞,利用0.25%胰蛋白酶冷消化4 h获得传代细胞,利用CASY系统计数后计算细胞的黏附率,倒置相差显微镜下观察原代干细胞及传代细胞的形态学变化,观察干细胞表面标志物整合素β1、CK19,细胞分化的表面标志物CK10的表达,以及各代细胞基因组的表达差异。结果原代干细胞的黏附率为(55.44±2.42)%,随着传代次数的增加,2代、4代及6代细胞的黏附率分别为(44.30±2.76)%、(30.95±2.24)%、(20.64±1.37)%,与原代细胞相比,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞生长融合时间随着传代次数而增加。各代细胞均表达整合素β1;原代、2代及4代细胞表达CK19,但6代细胞不表达CK19;部分6代细胞表达CK10。原代及4代细胞基因组比较结果相近,但与6代细胞结果差异较大。结论与原代干细胞相比,体外培养的人表皮干细胞在4代以后生物学特性发生改变,体外实验宜选用4代以前的细胞。

高敏度小张力膜状生物材料力学检测装置改进

目的改进本实验室与重庆大学联合研制的高敏度小张力膜状生物材料力学检测装置并测试其准确度及稳定性。方法①将原仪器液-气压力加载系统改为气体加载系统;②将夹具升级为可轴向运动,夹持稳固、精确,可视的夹持系统;③更换为高精度、量程为20kPa的传感器,并对系统软件内参数作相应调整;④对仪器准确度、稳定性进行测试。结果①成功地将原仪器改进成外形小巧,夹持可靠,试件变化可视,操作方便、快捷的装置。②准确度测试结果:引用误差为-0.30%～+0.29%之间。③稳定性测试:不同日期5个不同时段测得同一标准品的数据[分别为(18723±16)、(18705±5)、(18720±23)、(18731±15)、(18733±20)Pa]之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论经改进后仪器能准确测量出组织工程皮肤等膜状生物材料的抗张强度。