锌指蛋白A20对小鼠内毒素性肝损伤的保护作用研究

目的探讨锌指蛋白A20对小鼠实验性内毒素性肝损伤的保护作用。方法以内毒素血症小鼠为动物模型,采用尾静脉注射A20表达质粒的方法,观察A20转基因处理对内毒素血症小鼠肝组织内TNF-αI、L-1β水平以及肝脏病理损伤的保护。结果A20组LPS注射24h后肝组织匀浆TNF-α表达水平为(923.2±11.97)pg/ml、IL-1β为(996.43±15.32)pg/ml,与LPS对照组比较,t检验显示P值均<0.05,A20组与LPS对照组之间TNF-α和IL-1β水平差异有统计学意义。病理分析提示A20组24h后小鼠肝脏病理损伤明显较LPS对照组轻。结论A20能够明显抑制内毒素血症小鼠肝组织的炎症反应,减轻肝组织炎症损伤。

钙调神经磷酸酶活性与皮层神经元轴突生长的相关性研究

目的研究钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)与皮层神经元轴突生长的相关性。方法原代培养大鼠大脑皮层神经元。细胞分为正常对照组和环孢霉素A(Cyclosporin A,CsA)处理组。CsA处理组是在细胞更换无血清的NB培养基2h后加入10nmol/L CsA刺激。采用倒置相差显微镜和数码影像采集系统观察培养3、7、10d的神经元,并用SPOT软件测量神经元轴突长度。CaN活性采用酶底物显色的方法进行检测。结果10nmol/L CsA刺激后3d和7d的神经元轴突均能较显著地增长(P<0.05),而这种作用在10d更为明显(P<0.01);而所有时相点神经元CaN的活性均受到显著抑制(P<0.01)。CsA处理组各时相点CaN活性与皮层神经元轴突的长度均呈显著负相关(r=-0.994,-0.990,-0.998,P<0.01)。结论CaN活性与皮层神经元轴突的生长呈负相关。

汽车碰撞防护栏致交通伤的动物实验模型

目的:应用实车进行碰撞实验,探讨轿车与防护栏相碰撞交通伤发生情况和伤情特点。方法:实验于2004-07/12在解放军交通医学研究所进行。选择重庆本地中国家养普通白猪10只,分为驾驶员组和前排乘员组,每组5只。以坐姿分别固定于驾驶员座椅上和前排乘员座椅上,以49km/h的行驶速度和45°角与右侧防护栏相撞。观察事故现场0h至伤后24h两组猪存活情况,损伤组织形态学改变[(包括损伤部位、损伤定级评分(AIS)、肺含水率、肺体指数及损伤严重程度评分(ISS)]。参照器官损伤定级(OIS)和简明损伤定级标准(AIS-98,0分为正常,分值越高表示损伤越严重),损伤程度评分(ISS)为身体3个最严重损伤区AIS评分的平方和。结果:纳入家猪10只均进入结果分析。①两组猪存活及损伤情况:驾驶员组家猪全部存活24h,前排乘员组家猪伤后4h全部死亡、其中死于事故现场3只。家猪伤后体表损伤较轻,内脏器官损伤严重,平均损伤定级标准(AIS)评分为3.41±0.97,最高分驾驶员组低于前排乘员组(2.80±0.84,4.00±0.70);肺含水率和肺体指数驾驶员组均低于前排乘员组[(75.95±5.26)%比(84.70±6.34)%;(0.81±0.10)比(1.19±0.11)];损伤严重度评分(ISS)驾驶员组亦低于前排乘员组(22.40±3.65,33.80±5.89);器官损伤定级在较重至危重范围。损伤伤类主要为撞击和挤压所致钝挫撕裂伤。②两组猪损伤组织形态学改变结果:主要表现为肢体骨折,心、肺、肝、脾、胃肠等器官不同程度的损伤破裂和出血,伤后肺水含量明显增加。组织切片光镜观察可见细胞变性、坏死,肺泡毛细血管损伤、肺间质及肺泡内有血液渗出及间质性肺水肿。结论:车辆侧向碰撞防护栏非常危险,交通伤发生率高,伤型伤类复杂,前排乘员侧动物伤情重于驾驶员侧动物,多并发重要脏器损伤。

应激模型的生理学基础及其比较研究进展

各种外界因素如创伤、手术、感染、缺氧、强光、噪音等通过一定强度作用于机体可以引起机体特异性和非特异性反应,非特异性反应与刺激因素性质无直接关系,称为应激(stress)。近年来,随着社会的发展,生活节奏的加快、自然环境和生活环境的恶化,应激已经成为威胁人类健康的重要因素,有关应激影响机体健康的研究备受国内外学者的重视,而合适的应激动物模型的建立对应激研究的顺利开展有着重要意义。本文就目前应激动物模型的病理生理特点、种类、制作和评价方法等进行综述,旨在为应激研究提供参考。

锌指蛋白A20对人单核细胞LPS应答的影响

目的调查锌指蛋白A20表达对人单核细胞LPS应答的影响,探讨A20可能的炎症调控作用与机制及其潜在的临床应用价值。方法采用细胞转染技术制备锌指蛋白A20人单核细胞转基因细胞模型和基因沉默细胞模型,以LPS攻击细胞,用适时荧光定量PCR技术测定锌指蛋白A20表达水平,用ELISA技术分析细胞核转录因子NF-κB活性及其依赖性炎性细胞因子TNF-α水平。结果锌指蛋白A20过表达组细胞遭受LPS攻击后其NF-κB活性和TNF-α水平明显低于LPS对照组(P<0.01),锌指蛋白A20基因表达抑制组细胞其NF-κB活性和TNF-α水平明显高于LPS对照组(P<0.01)。结论锌指蛋白A20对人单核细胞LPS应答具有明显的调节作用,可以明显降低炎症重要核转录因子活性和降低促炎细胞因子的表达。对脓毒症过度炎症反应实施干预具有潜在的临床应用价值。

大鼠下丘脑神经元培养的新方法

目的通过对大鼠下丘脑神经元培养方法的改进研究,寻找更佳的下丘脑神经元培养方法。方法基于目前常用的Neurobasal+B27+GlumaxⅠ的神经元培养体系,采用多重过滤替代原来的取上清过滤的方法处理神经元,并对换液方式作出相应调整。以NF-200对细胞进行免疫组织化学染色鉴定。通过观察比较培养下丘脑神经元的细胞密度、神经元轴突长度和胞体面积等指标,对培养方法作出评价。结果2种培养方法均获得良好的培养效果,改进的方法在细胞密度,3、7、10、12 d 4个时间点均优于原培养方法;神经元轴突长度和胞体面积方面,新方法只在3 d时优于原方法,至7 d时二者差异已不明显。结论新方法具有稳定的可重复性,可应用于神经元的培养实验。

珊瑚姜油对常见耐药菌的抑菌作用及急性毒性实验

目的研究珊瑚姜油(Zingiber corallinum Hanceoil)对耐药菌的作用以及珊瑚姜油的急性毒性,以确定珊瑚姜油的抗菌作用和安全性。方法纸片法药敏实验,探讨珊瑚姜油对耐药菌的抑菌作用。通过空腹灌胃法,观察珊瑚姜油对小鼠毒性反应,测定半数致死剂量(LD50)。结果珊瑚姜油对耐药革兰阴性大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟杆菌、鲍曼不动杆菌有明显的抑菌作用(P<0.05),对铜绿假单胞菌的抑菌作用不明显,但与对照组比较差异仍有统计学意义(P<0.05);对耐药革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌也有一定的抑菌作用(P<0.05)。松油烯-4-醇含量为79%的珊瑚姜油的抑菌作用明显好于含量为34%的珊瑚姜油(P<0.05)。珊瑚姜油LD50为1 790.427 mg/kg。结论珊瑚姜油为低毒性药物,对耐药菌有明显的抑菌作用,松油烯-4-醇是其主要的抑菌成分。

冲击伤复合缺氧后大鼠血清TNF-α与IL-8含量的变化

目的探讨大鼠冲击伤、冲击伤复合缺氧后血清TNF-α、IL-8的含量变化特点及其对伤情的判断意义。方法80只大鼠按随机数字表法分为3组,即正常对照组(NG,n=8)、单纯冲击伤组(BG,n=36)和冲击伤复合缺氧组(BHG,n=36)。致伤组动物用BST-Ⅰ型生物激波管致冲击伤,BHG组大鼠再置入体积分数为12.5%的低氧舱,于伤后1、3、6h处死大鼠,采用大体、光镜和电镜方法观察伤后肺病理学变化和肺含水率,并用ELISA法监测血清TNF-α和IL-8含量变化。结果受伤动物可见明显的肺出血、肺水肿,BG和BHG组动物肺含水率及血清TNF-α和IL-8含量均明显高于NG组(P<0.01),其中BHG组血清TNF-α和IL-8含量在伤后6h又显著高于BG组(P<0.05)。结论冲击伤复合缺氧能明显增加血清TNF-α和IL-8含量,其水平变化可能与肺损伤程度密切相关。

创伤感染时巨噬细胞表面模式识别受体表达、相互作用及其与炎症反应发生的关系

目的从免疫细胞表面模式识别受体水平揭示创伤感染条件下炎症反应的发生机制,为探寻有效调控炎症反应的措施提供新思路。方法选择小鼠内毒素血症、盲肠结扎穿孔、肺泡巨噬细胞免疫刺激模型,以免疫组织化学法和RT-PCR法检测主要模式识别受体的表达;利用细胞转染模型研究CD14、TLR4、MD-2相互作用及其与跨膜信号转导的关系。结果免疫细胞清道夫受体和CD14、TLR4、MD-2,分别呈现下调和上调表达,且转染CD14、TLR4和MD-23种表达质粒的HEK293细胞株对FITC-LPS结合率最强(P<0.05),在内毒素刺激后NF-κB活性、TNF-α分泌最显著(P<0.05)。结论免疫细胞表面防御性受体下调和效应性受体上调参与炎症反应失控过程,调控模式识别受体表达对减轻机体炎性损伤有重要意义。

肾上腺切除大鼠冲击伤后天然免疫功能的变化及其与模式识别受体的关系

目的下丘脑-垂体-肾上腺轴分泌的神经内分泌激素对天然免疫功能具有重要调控作用。本研究通过切除大鼠双侧肾上腺,观察冲击伤对大鼠主要天然免疫学指标的影响及其与模式识别受体表达的关系。方法Sprague-Dawley成年大鼠在肾上腺切除7d后遭受中度冲击伤,观察外周血白细胞数目,腹腔巨噬细胞吞噬大肠杆菌功能、肝脏、肺脏和肠系膜淋巴结细菌移位以及肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的变化,进而检测肺组织SR-A、CD14、TLR4mRNA的表达。结果肾上腺切除抑制冲击伤后外周血白细胞减少,腹腔巨噬细胞吞噬功能减弱,肝、肺、肠系膜淋巴结细菌移位以及肺组织TNF-α分泌在肾上腺切除后也进一步增强。肺组织SR-A、CD14、TLR4mRNA在肾上腺切除后减少,并伴有显著的炎症反应和组织损伤。结论肾上腺激素能增强创伤后机体的天然免疫反应,且与SR-A、CD14、TLR4介导密切有关。

X盒结合蛋白1在低浓度皮质酮对巨噬细胞免疫功能调控中的作用

目的探讨X盒结合蛋白1(X-box binding protein1,XBP1)在低浓度皮质酮对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能调控中的作用。方法分离培养成年健康雄性C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞,应用XBP1-RNAi慢病毒或阴性对照慢病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞,采用荧光显微镜观察感染效率,感染3、5d后收集巨噬细胞提取总RNA,应用RT-PCR检测小鼠腹腔巨噬细胞XBP1mRNA表达水平和干扰效率。XBP1-RNAi慢病毒或阴性对照慢病毒感染离体培养的小鼠腹腔巨噬细胞3d后,再应用低浓度皮质酮(50ng/ml)处理小鼠腹腔巨噬细胞1h,分别应用ELISA法及激光共聚焦显微镜检测小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中TNF-α生成及其吞噬功能变化。结果当复感染指数(multiplicity of infection,MOI)值≥6时,XBP1-RNAi慢病毒能有效地感染小鼠腹腔巨噬细胞,感染效率>75%。应用RT-PCR检测发现XBP1-RNAi能有效地抑制小鼠腹腔巨噬细胞XBP1基因表达。通过选择性地沉默XBP1基因表达,低浓度皮质酮(50ng/ml)对巨噬细胞吞噬功能增强的作用受到抑制,巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数均显著下降(P<0.01),而且对TNF-α分泌增强的作用也受到抑制,显著低于阴性对照慢病毒组(P<0.01)。结论采用RNA干扰选择性地沉默XBP1,能有效地抑制低浓度皮质酮对巨噬细胞吞噬和TNF-α生成增强的作用。

人pri-miR-155重组腺病毒的制备及其表达与活性鉴定

目的制备表达人成熟miR-155的重组腺病毒,检测该免疫调控分子在肺癌细胞A549的表达及其生物学活性。方法以正常人基因组DNA为模板,PCR扩增约1000bp完整的pri-miR-155基因序列,克隆到T载体pTA2上,测序证实后,正向亚克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建pAdTrack-CMV/pri-miR-155重组质粒,与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒重组并扩增后转染293FT细胞,进行重组腺病毒的包装、扩增,对其进行安全性、滴度的测定。用此腺病毒感染A549细胞,采用RT-PCR法检测成熟miR-155的表达,双报告基因法检测其干扰活性。结果构建的人pAdTrack-CMV/pri-miR-155重组质粒经酶切及测序鉴定正确;用此腺病毒感染A549细胞后,RT-PCR检测成熟miR-155表达较无关序列病毒感染对照组显著增强。腺病毒感染A549细胞后,通过转染后双报告基因检测相对萤光素酶活性较对照组降低,显示此腺病毒感染A549细胞后,可有效表达成熟miR-155,并具有生物学活性。结论成功制备人pri-miR-155重组腺病毒,并在感染肺腺癌细胞A549后高效表达成熟有活性miR-155。

巨噬细胞趋化检测方法的建立及皮质酮对其趋化功能的影响

目的建立改良Boyden趋化小室(Boyden chamber)法检测巨噬细胞趋化功能的方法,探讨皮质酮对大鼠腹腔巨噬细胞趋化功能的影响。方法分离成年Sprague-Dawley(SD)大鼠腹腔巨噬细胞。应用48孔Boyden chamber趋化板检测趋化功能。下室加入27μL的10nM FMLP作为趋化剂或含1%牛血清清蛋白的RPMI-1640作为阴性对照,将50μL不同细胞密度的大鼠腹腔巨噬细胞悬液(3、6、12×106/mL)置于上室以确定最适细胞密度,将趋化装置置于5%CO2、37℃细胞培养箱内孵育2、3h以确定最适孵育时间。同时,以0、10、501、000ng/mL皮质酮处理大鼠腹腔巨噬细胞,应用Boyden chamber法检测巨噬细胞趋化功能。结果巨噬细胞对10nM FMLP趋化剂呈细胞密度依赖性增加,上室巨噬细胞密度为6×106/mL时为最适细胞密度,并且最适孵育时间为3h。低浓度皮质酮(10、50ng/mL)处理大鼠腹腔巨噬细胞其趋化指数显著高于对照组(P<0.01),而高浓度皮质酮(1 000ng/mL)处理后巨噬细胞趋化指数与对照组相比差异不明显。结论成功建立了改良Boyden chamber法检测巨噬细胞趋化功能方法,皮质酮可呈剂量依赖性地影响巨噬细胞趋化功能,在无免疫刺激状态下,低浓度皮质酮能增强巨噬细胞趋化功能。

皮质酮对动物骨髓间充质干细胞迁移活性的影响及其修复学意义

目的研究下丘脑-垂体-肾上腺轴效应激素———糖皮质激素(GC)对不同动物骨髓间充质干细胞迁移活性影响。方法分离、培养并鉴定大鼠和小鼠骨髓间充质干细胞,通过不同方法观察两种来源的骨髓间充质干细胞趋化活性的变化,评价GC对不同来源的骨髓间充质干细胞迁移活性的影响。结果尽管不同种属来源的骨髓间充质干细胞在形态上存在一定差异,但一定浓度的GC能够显著增强其趋化活性(P<0.05)。结论急性应激条件下,骨髓间充质干细胞迁移活性增强对损伤组织修复具有潜在的临床意义。

促肾上腺皮质激素释放激素基因敲除小鼠的繁殖与基因型鉴定

目的探讨促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)基因敲除(KO)小鼠饲养、繁殖及基因型鉴定的方法。方法从美国Jackson实验室引进CRH KO小鼠,按照遗传学规则,对杂合子型(CRH+/-)小鼠进行配对繁殖,提取幼鼠尾部组织全基因组DNA,通过聚合酶链反应(PCR)对幼鼠基因型进行鉴定。结果 CRH KO纯合子型(CRH-/-)小鼠的繁殖和饲养均获得成功,采用PCR成功地对所获得的小鼠进行基因分析,在子代小鼠中存在野生纯合子型(CRH+/+)、杂合子型(CRH+/-)及CRHKO纯合子型(CRH-/-)小鼠。CRH-/-小鼠较另外2种基因型小鼠存活率明显下降,但3种基因型小鼠在出生后10 d及30d体质量无明显差异。结论正确的饲养繁殖以及鉴定方法可从杂合子型(CRH+/-)小鼠中获得CRH KO纯合子型(CRH-/-)小鼠。

重组人A20蛋白在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达

目的利用酵母表达技术制备重组人A20蛋白(rhA20),为进一步研究其在脓毒血症中的治疗作用奠定基础。方法利用基因工程技术构建rhA20毕赤酵母表达载体yevCFP-hA20,电转化巴斯德毕赤酵母菌株GS115,筛选高拷贝阳性菌株,甲醇诱导表达rhA20。产物用SDS-PAGE和W estern B lot鉴定。同时对诱导表达培养基的pH值和配方,以及培养环境温度等条件进行了优化研究。结果表达产物分子量约93×103,表达条件的优化研究提示:降低诱导培养基pH值、添加低剂量EDTA、蛋白酶水解物和降低培养温度,可以使全长表达产物提高11倍,占总蛋白的18.24%,达到(254.10±24.52)μg/m l水平。结论我们成功在巴斯德毕赤酵母GS115中表达了rhA20,通过对诱导培养基成分及诱导温度的优化,使全长rhA20表达得到明显提高,探索了人A20的生物合成途径,也为巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白遭遇降解时的处理提供了新的方法。

皮质酮对大鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

目的进一步明确天然糖皮质激素对巨噬细胞免疫功能的影响及其时效和量效关系。方法收集大鼠腹腔巨噬细胞，分别用10～1000ng／ml的皮质酮（corticosterone，CORT）刺激，检测细胞的黏附、趋化和吞噬功能；使用ELISA试剂盒检测细胞培养上清中TNF-α的含量。结果50ng／ml的皮质酮显著增强巨噬细胞的黏附功能（P〈0．05），10ng／ml和50ng／ml的皮质酮刺激细胞后，其趋化功能均显著增加（P〈0．05）。同时，50ng／ml的皮质酮还可显著增强巨噬细胞的吞噬功能（P〈0．05）和促进巨噬细胞分泌TNF-α（P〈0．01），而使用高浓度皮质酮（500ng／ml和1000ng／m1）处理时，巨噬细胞的上述功能增强趋势减弱或无增强；在0．5—5h范围内，皮质酮处理1h时细胞的吞噬功能和分泌TNF-α的功能增强最明显，刺激更长时间后其功能的增强趋势逐渐减弱。结论一定剂量的天然糖皮质激素急性刺激可明显增强免疫功能。

大鼠表皮基底层干细胞体外分离与培养

目的建立简单、可靠的大鼠表皮基底层干细胞体外分离培养方法。方法取新生大鼠背部皮肤,采用胰酶两步消化法获得单细胞悬液,Ⅳ型胶原差速贴壁法富集干细胞,将慢黏附细胞作为对照组细胞,均以角质形成细胞无血清培养基培养。以β1-整合素和角蛋白19(K19)双重荧光染色鉴定细胞表型,克隆形成实验检测细胞体外增殖能力。结果分离培养的细胞为多角形、呈铺路石样排列,倍增时间约为24h,细胞形态和生长规律符合基底层干细胞的特征。免疫荧光鉴定显示细胞共表达β1-整合素和K19,基底层干细胞克隆形成能力显著强于对照细胞。结论两步消化联合Ⅳ型胶原差速贴壁法获取基底层干细胞简易可行,培养的细胞活力好、表型可靠。

细菌脂多糖、脂蛋白和DNA对小鼠肺泡巨噬细胞体外激活的协同作用

目的通过体外实验,从受体水平观察细菌脂多糖(LPS)、细菌脂蛋白(BLP)和细菌DNA对肺泡巨噬细胞的协同刺激效应及其可能机制。方法分离培养小鼠肺泡巨噬细胞,随机将细胞分为7组,分别为LPS组、CpGODN组、BLP组、LPS+CpGODN组、LPS+BLP组、LPS+CpGODN+BLP组和培养基对照组。刺激6h后,收集上清和细胞,上清用于TNFα检测,细胞用于提取总RNA,通过RTPCR检测主要模式识别受体(PRRs)CD14、SR、TLR2、TLR4、TLR9的表达。结果LPS、BLP和CpGODN不仅体外能协同增加肺泡巨噬细胞释放TNFα等细胞因子,而且具有协同增强效应细胞表面模式识别受体的表达,以三者同时存在时,协同作用最强。结论细菌内毒素、细菌脂蛋白和细菌DNA在体外不仅能上调相互的模式识别受体,而且具有协同增强其他细菌结构成分对相应受体的刺激作用。