MLST分析在病原微生物基因分型应用中的研究进展

鉴别细菌的方法有很多，其中有针对其表型、特异性的血一清型的方法；还有单克隆抗体等免疫学分型，（这些方法的缺点是其有限的抗原不能够代表全基因组的，不能预测分型反应。然而随着分子生物学技术的不断发展，微生物的基因分型已占据了十分重要的地位。

四川榨菜后熟时期微生物区系的初探

通过对四川榨菜后熟期间微生物区系作初步的分析，了解４大类微生物的数量变化规律，并对所分离到的微生物鉴定到属。

四川榨菜后熟时期微生物区系的研究

通过对四川榨菜后熟期间微生物区系作初步的分析 ,了解四大类微生物的数量变化规律 ,并对所分离到的微生物鉴定到属。

病原微生物基因多位点序列分型的研究进展

多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)是近年来发展很快的分子生物学分析方法,具有很高的分辨能力,既适于分子流行病学研究,也可用于分子进化学的研究。通过分析多个管家基因(Housekeeping gene)450bp左右的核心片段的核酸序列,从而对菌株的等位基因进行多样性的比较,不同的菌株对应不同的序列型(Se-quence type)。所以MLST越来越多的被作为能进行国际间菌株比较的常用工具,建立一种更为准确的分型系统方法。并且应用于研究出现的不同的抗生素抵抗株,毒力或抗原的相关特殊基因型,及新的变异株引起的疾病流行等流行病学分析,进行生物进化和种群结构的研究。

微生物相变研究概况

微生物相变研究概况第三军医大学临床微生物教研室重庆６３００３８刘俊康，徐启旺１９２２年Ａｎｄｒｅｗ［１］首次描述了连续传代培养的伤寒沙门氏菌鞭毛抗原的相变现象，之后Ｓｔｒｏｋｅｒ等［２］证实，Ｑ热立克次休存在着相变异现象，在豚鼠传至３０８代的Ｑ热立克...

加强微生物学实验教学各环节,努力提高实验课质量

微生物学是一门技术性很强的实验学科,其独树一帜的实验技术在学科发展中占据着突出的位置。自从荷兰人列文虎克创制出人类第一台显微镜向人们展示微生物的存在以来,微生物学的发展日新月异,尤其是现在。

肾移植术后体表微生物群的变化与感染的监测

本文对肾移植术后病人体表微生物群的变化进行了连续动态的观察。正常人体表微生物群主要为革兰阳性球菌、阴性球菌和阳性杆菌,感染发生前这些微生物群发生了不同程度的变化。24个病例中有22人发生了体表革兰阴性杆菌定植,其中有19人在革兰阴性杆菌定植后的2天～3周后并发了不同程度的泌尿道、肺部、伤口、血液和其它体液的同种细菌感染,并发严重感染的7例病人中有6例表现为全身性革兰阴性杆菌定植。绿脓杆菌、大肠杆菌、不动杆菌和沙雷氏菌是常在体表定植的致病菌。作者认为:皮肤正常菌群的改变和病原性革兰阴性杆菌定植是监测肾移植术后感染,尤其是严重感染的有效手段。病人的口咽部和腹股沟等处是引起感染的革兰阴性杆菌持续稳定的贮菌所,全身性同种革兰阴性杆菌定植是严重感染的征象。

微生物与人类进化

根据现代分子生物学知识和微生物知识，认为基因重组方式可能是人类进化的一种主要方式；并认为微生物能通过基因重组有效介导自身基因和各种生物基因流向人类；从原核生物到真核生物中广泛存在的转座作用可能是微生物介导的基因重组的一种重要方式；高等生物是由低等生物进化而来的，而微生物是进化上最早最低级的生命体。据此，认为微生物可能在人类进化和物种进化中起到了极其重要的作用，甚至可能是一种源泉的作用。其可能方式是：微生物先感染其它生物，携带上该种生物的遗传物质，再感染人类，将所携带的遗传物质转移到人类基因组。

四川榨菜后熟时期微生物区系的研究

通过对四川榨菜后熟期间微生物区作较全面的分析，可了解四大类微生物的数量变化规律，并鉴定出 １６ 属，１５

霍乱毒素及大肠杆菌不耐热肠毒素生物学特性的研究

霍乱毒素(cholera toxin,CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT)随着传染病和流行病学的发展得以关注,近年由于疫苗的进展再次得到重视,它们是细菌蛋白毒素家族成员,通过G蛋白的ADP-核糖基化而发挥其毒性。两者关系密切,氨基酸序列同源性约80％,均包括一个240个残基的A链和5个103个残基的B亚单位,即AB_5六聚体,B五聚体与GM_1神经节苷脂受体结合,决定毒素对宿主细胞的选择亲和性,A亚单位有使上皮细胞G蛋白Gsα的一个精氨酸残基ADP-核糖基化的活性,两者具有较强的粘膜免疫原性和粘膜免疫佐剂效应。了解其结构、粘膜免疫机制,对于粘膜疫苗的发展有重要指导意义。

人补体受体1型衍生分子融合基因CR1-SCR2D的构建、表达及生物学活性鉴定

目的构建和表达具有抑制补体生物活性的双功能域人补体受体1型衍生分子CR1-SCR2D。方法基于我室前期工作,将CR1-SCR1-3、人工α螺旋肽段linker、SCR15-17 3个DNA片段依次克隆到改造载体pPIC9k(+)和pPICZαB,构建出表达质粒pPICZαB-CR1-SCR2D;电转化毕赤酵母X-33得到阳性重组子,甲醇诱导目的蛋白CR1-SCR2D表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达结果;经纯化获得CR1-SCR2D并进行糖基化鉴定后,用CH50和AH50法鉴定目的蛋白在体外抑制补体的生物活性。结果成功构建了目的基因的表达质粒pPICZαB-CR1-SCR2D,基因测序正确;SDS-PAGE和Western blot证实目的基因在毕赤酵母中实现了分泌表达;经镍柱纯化后得到较纯的CR1-SCR2D,糖基化鉴定证明其存在糖基化;CH50法和AH50法结果显示CR1-SCR2D均有较CR1-SCR1-3和CR1-SCR15-17更好的抑制补体生物学活性。结论成功构建了双功能域人补体受体1型衍生分子融合基因CR1-SCR2D,在毕赤酵母中实现了CR1-SCR2D的分泌表达,该融合蛋白对经典/MBL途径及旁路途径补体激活均具有较好的抑制作用。

适度运动对人体肠道菌群结构的影响

目的适度运动有益于身心健康。本研究从肠道菌群结构的角度来探讨运动对人体健康的影响。方法招募运动组和少动组志愿者人群,利用16S r DNA高通量测序技术分析志愿者肠道菌群结构。结果高通量测序共获得61 888个OTUs,其中已注释的OTUs有61 149个。PCo A分析显示,运动组和少动组之间肠道菌群结构存在显著差异。运动组中毛螺菌科(Lachnospiraceae)和拟杆菌科(Bacteroidaceae)的丰度显著高于少动组(P=2.5627×10^(-7),P=0.000 178 4),普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)的丰度显著低于少动组(P=0.000 003 46,P=0.000017 41)。有3株可培养的菌株在运动组中丰度显著增加,分别为瘤胃球菌属的Ruminococcus_sp.5_1_39BFAA,双歧杆菌属的Bifidobacterium_adolescentis以及丁酸产盐菌属的Anaerostipes_hadrus。在运动组中显著增加的肠道菌,如拟杆菌科,双歧杆菌属的Bifidobacterium_adolescentis以及Anaerostipes_hadrus,能够代谢产生丰富的SCFAs,对肠粘膜免疫系统动态平衡的维持具有重要意义。结论运动可能通过肠道菌群结构的改变及其与肠黏膜系统的相互作用对人体产生积极影响。

从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位

目的 建立一种有效的方法，从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位（rUreB）。方法重组大肠杆菌发酵后，表达的rUreB包涵体经洗涤、变性、复性，采用Q Sepharose Performance阴离子交换层析和Pheny1 Sepharose High Performance疏水层析分离纯化。使用 SDS－PAGE和HPLC检测纯度，选用 ELISA和 Western－bloning对纯化蛋白的生物学活性进行鉴定。结果 rUreB包涵体经洗涤和溶解后，rUreB的纯度＞70％。包涵体溶解液经阴离子交换层析和疏水层析后纯度超过95％。rUreB纯品具有良好的生物学活性。结论 建立了从包涵体中获得高纯度的rUreB的工艺，为进一步的研究打下了基础。

分支杆菌临床分离株的16S rRNA基因序列分析

目的 建立分支杆菌的 16SrDNA序列分析的方法 ,采用该方法鉴定临床结核分支杆菌分离株。方法 用PCR从重庆某医院的肺部感染病人的痰标本中分得的 2 9株分支杆菌菌株中扩增 16SrRNA基因 (16SrDNA)的 5′端片段 (～5 0 0bp) ,并测定所得到片段的DNA序列。用DNA分析软件将所获得的序列与GenBank的分支杆菌序列相比较 ,计算种间相似性 ,并用序列构建分支杆菌菌株的系统发育树 ,对分离株进行分类与鉴定。结果 有 14株的 16SrDNA序列分别与已知结核分支杆菌复合群 (Mycobacteriatuberculosiscomplex ,MTC)、戈登分支杆菌、新金色分支杆菌、氯酚红分支杆菌、龟分支杆菌或脓肿分支杆菌的序列完全相同。依据完全一致的序列可以准确鉴定这些临床分离株为相应的种 ;部分分离株的 16SrDNA在GenBank序列检索中无完全一致的匹配序列。用临床分离株的 16SrDNA序列与已知的分支杆菌 16SrDNA序列构建的系统发育树 ,结果提示某些菌株可能是与已知分支杆菌密切相关的新种或是它们的亚种。结论 16SrDNA序列分析鉴定分支杆菌是一种快速、可靠、成本较低的方法 ;

FOXO1在胰岛β细胞中的表达及对增殖凋亡功能的影响

胰岛功能受损的分子机制研究是揭示2型糖尿病(T2DM)发病机制的核心问题.FOXO1是胰岛素信号下游的重要靶转录因子,参与胰岛的发育,但在分化成熟的胰岛β细胞中的功能尚未阐明.本研究采用免疫组化方法结合激光共聚焦技术观察FOXO1在胰岛的表达及细胞定位;通过基因介导的转移技术和siRNA干预技术,在培养的大鼠胰腺癌β细胞系(INS-1E)中特异高表达组成性活性的FOXO1(FOXO1-AAA)或抑制其表达水平,观察FOXO1表达水平的改变对β细胞增殖、凋亡的影响.免疫组化结果显示,FOXO1在正常胰腺组织中仅特异地表达在胰岛内.采用胰岛素与FOXO1的免疫荧光双标结合共聚焦观察进一步揭示,FOXO1主要表达在胰岛的β细胞中.Western印迹显示,腺病毒介导的基因转移技术在体外培养的INS-1E细胞中过表达FOXO1-AAA或其特异的siRNA均能有效地上调或抑制其表达水平.3H-TdR掺入实验结果显示,降低FOXO1的表达显著促进细胞增殖;反之,高表达FOXO1显著抑制细胞增殖.与之相应,MTT检测结果显示,降低FOXO1的表达对细胞存活有显著促进作用,高表达FOXO1对细胞存活有显著抑制作用.进一步采用流式细胞仪检测细胞凋亡,结果显示降低FOXO1的表达使β细胞凋亡率降低,反之高表达FOXO1使β细胞凋亡率增加.研究结果证实,胰岛β细胞中的FOXO1参与β细胞的存活、增殖、凋亡的调节.病理性高表达FOXO1可能通过阻止β细胞增殖、促进β细胞凋亡从而减少β细胞的数量,在T2DM发生中可能起重要作用.

储存喷气燃料中悬浮物与真菌的相关性研究

采用显微镜观测、能量色散X射线分析(EDX)、颗粒数测定、真菌培养及鉴定和聚合酶链式反应(PCR)扩增及凝胶电泳检测手段,研究了储存喷气燃料中悬浮物与真菌的相关性。结果表明,在光学显微镜下能看到储存喷气燃料中的悬浮物有如真菌菌丝特有的横隔结构;悬浮物的元素主要为C、N、O,说明其主要由有机质组成。含有悬浮物的储存喷气燃料用0.45μm滤膜过滤(除去孢子)并加入去离子水,放置75d后各级颗粒数无明显变化,而未过滤(含有孢子)者放置75d后各级颗粒数显著增加。悬浮物样品在沙保氏、PDA培养基上能长出真菌菌落,其菌丝的尺寸、结构与悬浮物的相一致。悬浮物样品经PCR扩增并用琼脂糖凝胶电泳检测,均得到与真菌DNA提取液相同的条带,表明悬浮物中含有真菌DNA。因此,真菌与喷气燃料中悬浮物的形成密切相关。

糖组学研究技术及其进展

多细胞生物机体内,蛋白质糖基化是一个重要后修饰事件. 蛋白质的糖链不仅仅是区别细胞种类的标志,且与众多的生物现象有关,如细胞发育、分化、形态、肿瘤转移、微生物感染等. 糖组学的内容主要涉及单个个体的全部糖蛋白结构分析,确定编码糖蛋白的基因和蛋白质糖基化的机制. 综述了糖组学的分离和结构鉴定技术及其最新进展.

磷蛋白组的研究技术及其进展

真核细胞中蛋白质磷酸化是一个重要事件。真核细胞利用可逆的蛋白磷酸化来控制许多细胞过程包括信号转换、基因表达、细胞周期等。磷蛋白组的研究涉及磷蛋白的分离和鉴定 ,磷酸化残基定位和定量分析。由于蛋白质磷酸化是一个动态过程 ,在细胞中磷蛋白含量低 ,磷酸化位点可变 ,且磷酸肽的质谱信号常常会受到抑制 ,所以磷蛋白的分析存在更多的困难。本文介绍了国内外在磷酸蛋白的分离鉴定及定量分析方面的研究技术以及进展情况。目前 ,质谱仍然是核心的鉴定技术 ,寻找更好富集方法是最大的挑战。定量蛋白组学是对蛋白质的差异表达进行精确的定量分析。目前还不存在一种独立的方法可以完成磷蛋白的分离、鉴定 ,以及磷酸位点的定位和定量分析。随着样品分离技术和相关仪器的发展 ,磷酸蛋白快速、准确、全面分析鉴定将能够实现。

长程高脂肪膳食对大鼠空腹血糖及糖耐量的影响

研究了单纯高脂膳食喂养对大鼠空腹血糖（Fasting plasma glucose，FPG）及葡萄糖耐量（Glucose tolerance test，GTT）的影响，旨在模拟与现代人生活饮食结构及发病情况更为接近的糖调节异常动物模型．取正常SD大鼠100只喂以普通饲料或高脂饲料14mo，动态监测动物体重及空腹血糖的变化，并分别在第5、8、10、14mo时用糖耐量试验观察葡萄糖耐量减退（IGT）的情况．结果显示，高脂喂养第1～14个月过程中，雄性太鼠的体重较普食组均未出现显著增加，而雌性大鼠体重仅在喂养第5～8个月期间较普食组增加了10％～15％；与普食组相比，在喂养高脂膳食第1～5个月中雌雄两性大鼠空腹血糖均显著升高，在喂养第5～10个月中雄性葡萄糖耐量显著减退，但雌性动物则未出现明显的IGT，至第14个月时雄性IGT与普食组的差异消失．研究表明，单纯高脂膳食虽不能诱发糖尿病，但可出现较典型的IFG空腹血糖受损和IGT现象，且以雄性动物造模更为适宜，喂养时间以10mo以内为宜．由于单纯高脂喂养更接近自然人群发病过程，因此，此种模型将为糖调节受损发生机制及其早期干预的研究提供新的动物模型．

抗隐孢子虫单克隆抗体研制及其特异性的鉴定

目的：制备抗隐孢子虫单克隆抗体（ＭｃＡｂ）并对其特异性进行鉴定。方法：用纯化的人源微小隐孢子虫卵囊免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，杂交瘤技术制备ＭｃＡｂ，间接免疫荧光（ＩＦＡ）和免疫印迹试验分析其特性。结果：制备出Ｚ４Ｃ８、Ｚ２Ｂ６、Ｚ３Ｄ７和Ｚ３Ｄ２四株能稳定分泌抗隐孢子虫ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞株。经鉴定，Ｚ４Ｃ８和Ｚ３Ｄ７为ＩｇＭ，Ｚ３Ｄ２和Ｚ２Ｂ６为ＩｇＧ１，轻链均为κ链，与多种肠道病原体及肺孢子虫无交叉反应。除Ｚ２Ｂ６在间接免疫荧光试验中识别卵囊壁外，其余均识别隐孢子虫子孢子（ＣＳＰ）。免疫印迹定位表明，四株ＭｃＡｂ分别识别４２条ＣＳＰ抗原中的２０．５ｋＤａ、６０．５ｋＤａ、３３ｋＤａ和９５ｋＤａ４个条带，其中Ｚ４Ｃ８和Ｚ３Ｄ７均识别２０．５ｋＤａ主要抗原带。结论：这四株ＭｃＡｂ在识别ＣＳＰ抗原表位上具有不同的特性，但对隐孢子虫抗原均呈高度特异性反应。