慢性肾衰竭血清对兔主动脉内皮细胞泛素-蛋白酶体途径的影响

目的研究慢性肾衰竭(CRF)血清对兔主动脉内皮细胞泛素-蛋白酶体途径的影响,初步探讨CRF血清对主动脉内皮细胞作用的可能机制。方法建立CRF兔模型,建模后12周,取CRF模型兔及正常兔下腔静脉血血清备用。原代培养健康兔主动脉内皮细胞,用正常兔血清或CRF兔血清刺激后,分别采用RT-PCR、Western blotting及特异底物反应法检测不同血清对主动脉内皮细胞泛素化蛋白、泛素激活酶(简称E1)mRNA表达,泛素化蛋白、E1、κB抑制因子(IκB)蛋白表达及蛋白酶体活性的影响。结果 CRF血清使主动脉内皮细胞泛素、E1mRNA表达增加,明显高于正常血清(P<0.01)。CRF血清对主动脉内皮细胞泛素化蛋白的表达无明显影响,但使E1蛋白表达增加,使蛋白酶体20S亚基活性增强,明显高于正常血清(P<0.01)。CRF血清使主动脉内皮细胞IκB蛋白表达降低,与正常血清相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 CRF血清可致兔主动脉内皮细胞泛素-蛋白酶体途径活化,进而影响NF-κB信号通路。

RNA干扰阻滞胸腺素β4表达对TGF-β1诱导人肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化的抑制作用

目的探讨RNA干扰阻滞胸腺素β4表达对TGF-β1诱导人肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化(EMT)的抑制作用。方法构建能表达针对胸腺素β4的小干扰RNA(siRNA)的重组腺病毒载体,以及表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照载体,分别感染人肾小管上皮细胞株(HKC),得到胸腺素β4表达受抑制的HKC-siTβ4和胸腺素β4表达未受影响的HKC-siC。根据用TGF-β1处理HKC、HKC-siTβ4和HKC-siC的情况,将培养的细胞分为4组:正常HKC组(C组),TGF-β1处理HKC组(T+C组),TGF-β1处理HKC-siTβ4组(T+siTβ4组)和TGF-β1处理HKC-siC组(T+siC组)。48h后,分别采用RT-PCR和Western blotting检测各组胸腺素β4、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏素表达,并分析胸腺素β4和α-SMA表达量的相关性。结果C组胸腺素β4表达弱阳性,α-SMA表达阴性,E-钙黏素表达强阳性;T+C组胸腺素β4和α-SMA表达强阳性,E-钙黏素表达较C组减弱(P<0.01);T+siTβ4组胸腺素β4和α-SMA表达弱阳性,表达量显著低于T+C组(P<0.01),E-钙黏素显著高于T+C组(P<0.01);T+siC组胸腺素β4、α-SMA和E-钙黏素表达与T+C组相比均无显著差异(P>0.05)。胸腺素β4和α-SMA表达呈显著正相关。结论RNAi阻滞胸腺素β4表达能有效地抑制TGF-β1诱导EMT,提示胸腺素β4是介导TGF-β1诱导EMT的重要分子。

Wnt阻滞剂Dickkopf-1对肾小管上皮细胞转分化的抑制作用

目的研究Wnt阻滞剂Dickkopf-1(Dkk-1)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞(HKC),收集后分3组:对照组细胞以含10%胎牛血清的培养基常规培养,TGF-β1组在常规培养基中加入TGF-β1(终浓度20ng/ml),TGF-β1+Dkk-1组同时加入TGF-β1(终浓度20ng/ml)和Dkk-1(终浓度100ng/ml)。培养48h后在倒置相差显微镜下进行形态观察,分别采用RT-PCR和Western blotting检测Wnt4、β-catenin、E-cadherin、α-SMA mRNA及蛋白表达情况,细胞免疫荧光染色观察E-cadherin和α-SMA的表达。结果与对照组比较,TGF-β1组和TGF-β1+Dkk-1组Wnt4 mRNA和蛋白表达水平均显著增高(P<0.05),后两组间差异无统计学意义(P>0.05)。β-catenin mRNA表达在各组之间差异无统计学意义(P>0.05)。β-catenin蛋白在对照组呈低表达,TGF-β1组表达明显上调,TGF-β1+Dkk-1组较TGF-β1组表达下调(P<0.05),与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。E-cadherin mRNA和蛋白在对照组呈高表达,TGF-β1组表达明显降低,TGF-β1+Dkk-1组较TGF-β1组表达显著增高(P<0.05),与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。α-SMA mRNA和蛋白表达在对照组和TGF-β1+Dkk-1组的表达均较TGF-β1组明显降低(P<0.05)。细胞免疫荧光染色显示E-cadherin和α-SMA表达与RT-PCR和Western blotting检测结果一致。结论 Wnt阻滞剂Dickkopf-1能抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化。