免疫磁分离及免疫比浊分析对福氏志贺菌的自动快速定量检测

目的以SPA包被的磁珠和富含SPA的金黄色葡萄球菌分别与福氏志贺菌的多抗血清结合,制备福氏志贺菌特异的多抗磁珠和抗体致敏的金黄色葡萄球菌作为协同凝集试剂与免疫比浊试剂,利用免疫比浊分析探索其在福氏志贺菌自动快速定量检测中的初步应用。方法福氏志贺菌F1a免疫日本大耳白兔制备多抗血清,磁珠包被SPA后再与多抗偶联,制成多抗免疫磁珠。以该磁珠捕获模拟标本的福氏志贺菌,接种MH平板37℃培养18～24h,菌落计数后计算免疫磁珠的特异富集作用。富含SPA的金黄色葡萄球菌(No1800株)经甲醛灭活后,与福氏志贺菌的多抗血清结合,制备特异抗体致敏的金黄色葡萄球菌,作为协同凝集试剂和自动定量检测的免疫比浊试剂,在日立7060全自动生化分析仪编制程序进行自动检测并进行初步的方法学评价。结果福氏志贺菌F1a免疫日本大耳白兔获得了高质量的多抗血清,特异性好,凝集效价达1∶320;制备多抗免疫磁珠对福氏志贺菌具有一定的富集作用,菌落计数显示磁珠处理的细菌捕获效率约为30%;抗体致敏的金黄色葡萄球菌,作为协同凝集试剂和自动定量检测的免疫比浊试剂,在玻片上能与待测福氏志贺菌产生明显的凝集现象,在日立7060全自动生化分析仪上定量检测灵敏、特异、线性良好。结论以福氏志贺菌的多抗血清分别致敏SPA包被的磁珠和富含SPA的金黄色葡萄球菌,制备特异的多抗磁珠对福氏志贺菌有一定的特异捕获与富集作用,抗体致敏的金黄色葡萄球菌作为协同凝集试剂与免疫比浊试剂对福氏志贺菌的自动、快速、定量检测具有较好的效果,为病原菌的快速诊断和自动定量分析提供了新的思路。

幽门螺杆菌cagT蛋白的表达、纯化及免疫原性研究

为了解析cagT蛋白的结构,进而了解cagT基因在幽门螺杆菌致病中的作用,应用PCR技术从幽门螺杆菌26695菌株基因组中扩增cagT基因,T/A法克隆,连接至pET-28a(+)载体,转化宿主细胞E.coliBL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,亲和层析法纯化目的蛋白,免疫家兔制备抗体并鉴定其抗原性.成功克隆cagT基因,重组cagT基因片段的测序结果与GenBank上公布的序列相同.重组cagT蛋白以可溶和包涵体两种形式表达,免疫家兔所得的抗体滴度为1∶32.结果构建了高效表达cagT蛋白的重组载体pET-28a(+)-cagT,表达的蛋白具有良好的免疫原性,为后续的结构和功能研究奠定了基础.

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位功能片段构建及免疫原性研究

目的构建表达免疫活性的尿素酶功能片段原核表达体系。方法根据尿素酶B基因序列以及文献报道的尿素酶活性中心区域,primer5.0设计相应的引物,以Hp基因组为模版,PCR扩增拟表达的尿素酶活性片段,经测序证实后将片段亚克隆于原核表达载体pET28中,转入宿主菌BL21后IPTG诱导表达后,Tris-Tricine PAGE电泳及抗Hp特异性抗体western-tbollting鉴定目的蛋白表达。结果PCR从Hp基因组中扩增出414bp目的片段,经酶切及测序证实构建了功能片段表达阳性重组子,命名为pU414,IPTG诱导后电泳分析可以发现相应分子量附近出现可疑目的蛋白,能够被特异性血清识别。结论成功建立尿素酶活性功能片段蛋白表达载体,为下一步实验研究奠定基础。

百日咳丝状血凝素分子中强免疫原性片段的筛选、克隆与表达

目的筛选百日咳丝状血凝素分子中强免疫原性的片段,并对其进行克隆及表达。方法采用生物信息学软件对丝状血凝素分子的结构进行预测,从中筛选出具有强免疫原性的片段FHAs。经PCR扩增,T-A克隆后,构建表达质粒pET-22b(+)-FHAs,酶切鉴定正确后测序。将测序正确的质粒转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达,并对表达产物进行Tricine-SDS-PAGE分析及Western blot鉴定。结果从丝状血凝素分子中筛选出具有138个氨基酸的肽段FHAs,经PCR扩增,得到约400bp的目的基因片段,构建的重组质粒经双酶切和测序鉴定,证明质粒构建正确,重组工程菌pET-22b(+)-FHAs/BL21经IPTG诱导,目的蛋白的表达量在50%以上,主要以包涵体形式存在。Western blot分析证实该蛋白能与抗FHA单抗发生反应。结论筛选出的肽段FHAs具有强的免疫原性和免疫反应特异性,为百日咳基因工程疫苗的研究奠定了基础。

重组人白细胞介素10在毕赤酵母中的表达及生物学活性测定

目的在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人白细胞介素10(rhIL-10),用于IL-10的生理功能研究和动物试验。方法通过PCR扩增IL-10基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位点处,再将融合基因αIL-10重组到表达质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,SalⅠ酶切线性化重组质粒IL-10/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的基因IL-10,甲醇诱导rhIL-10的表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定目的蛋白,用ELISA定量测定及MC/9细胞分析IL-10生物学活性。结果成功构建了重组表达质粒IL-10/pPIC9K,获得了4个含IL-10基因的高拷贝毕赤酵母转化子,甲醇诱导后,在摇瓶水平的IL-10表达量为(0.627±0.09)mg/L,比活性为1.5×105U/mg。结论毕赤酵母分泌表达的IL-10具有良好的生物学活性。

白细胞介素-10基因多拷贝表达盒的构建及在毕赤酵母中的表达

目的构建白细胞介素-10(IL-10)基因多拷贝表达盒,提高IL-10在毕赤酵母中的表达水平。方法体外构建重组表达载体αIL-10/pAO815,BamHⅠ和BglⅡ双酶切获得目的基因表达盒(AOX-αIL-10),再连接到BglⅡ酶切位点处,依次构建多拷贝重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815。从质粒pPIC9K上用NdeⅠ和SalⅠ双酶切获得Kan抗性基因,重组到多拷贝表达载体n(AOX-αIL-10)/pAO815上。重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815电转化毕赤酵母,PCR筛选含有IL-10基因的酵母转化子,甲醇诱导表达,对表达量高的转化子再次经重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815-Kan电转化,高浓度G418抗性筛选二次酵母转化子,使用甲醇诱导表达。ELISA测定IL-10含量,MC/9细胞测定IL-10活性。结果所构建的8拷贝表达盒的重组载体8(AOX-αIL-10)/pAO815和4拷贝表达盒4(AOX-αIL-10)/pAO815-Kan,转化子分泌表达IL-10水平最高,为(8.25±1.65)mg/L,比活性为1.465×105U/mg。结论已成功构建了高拷贝表达盒,并提高了IL-10在毕赤酵母中的表达水平。

在生物技术专业开展结构生物学第二课堂的实践与思考

结构生物学的研究内容与生物技术专业知识密切相关，开展结构生物学第二课堂活动可作为生物技术专业理论课程的重要补充，加深学生对专业知识的理解，提升教学质量。相关授课教师总结多年来针对生物技术专业学生开展结构生物学第二课堂的经验，认为精选的教学内容、合理的课堂设计、充分的课前准备、灵活的教学方式和客观的课后总结，有助于提高第二课堂教学质量。

幽门螺杆菌适应性定植相关基因HP0318的克隆及序列分析

目的测定幽门螺杆菌(HP)适应性定植蒙古沙鼠前后HP0318基因序列并分析其序列差异,以了解该基因在HP适应性定植过程中在基因水平是否发生了改变,为进一步研究HP的适应性变异机制提供实验依据。方法对幽门螺杆菌临床分离株M0、沙鼠适应株M13及标准株NCTC11637基因组中的HP0318全长基因进行扩增,然后连接到PMD18-T载体进行测序,最后通过DNAsis软件对不同菌株来源的HP0318基因进行多重序列比对,并与Genbank公布的2个标准株(HP26695株和J99株)的HP0318序列进行对比分析。结果PCR法成功扩增出了3个菌株的HP0318基因片段,克隆到PMD18-T载体上酶切鉴定正确。测序结果表明3株幽门螺杆菌(M0、M13、11637)的HP0318序列大小均为756bp。序列分析显示在不同来源的HP菌株中表现出较高的保守性,最低相似性达到94%。结论HP0318基因属于HP特异性基因,HP在沙鼠中适应性定植可能并不是由HP0318基因水平的变异引起,有必要进一步实验验证其功能和阐明其所具有的调控机制。

肠出血性大肠埃希菌O157:H7 espA基因的克隆与表达

目的通过DNA重组技术表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的EspA蛋白,并分析其免疫学性质。方法采用PCR技术从EHEC O157:H7基因组中扩增espA基因,T／A法克隆,连接至pET-28a(+)载体上,转化宿主细胞E．coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析法纯化目的蛋白, SDS-PAGE测定其相对分子质量,同时分析其N端氨基酸序列,免疫家兔鉴定其抗原性。结果重组espA基因片段的测序结果与GenBank上基因序列只有1个碱基不同,一致性为99．83％,所编码的氨基酸序列没有改变。重组EspA蛋白在工程菌中以包涵体的形式表达,表达量约30％。免疫家兔所得抗体滴度为1:32。结论构建高效表达EspA蛋白的重组载体pET-28a(+)-espA,表达的蛋白具有良好的免疫原性,为进一步制备亚单位疫苗奠定基础。

EHEC0157：H7紧密黏附素及突变体与受体Tir的结合特性研究

目的表达纯化肠出血性大肠杆菌（EHEC）0157：H7的紧密黏附素（intimin）及突变体intiminN916Y，并构建其转位紧密黏附素受体（translocatedint intin receptor，Tir）结合片段（intiminbinding domain，Tir-IBD），通过BIACore技术检测紧密黏附素及突变体intiminN916Y与Tit．IBD蛋白质相互作用特性的变化，探索特定氨基酸的突变对其黏附结合功能的影响。方法设计引物采用PCR法自EHEC0157：H7基因组扩增Tir—IBD的编码基因tir-~d，TA克隆后构建原核表达质粒pET-21a（＋）-tir—ibd，经测序鉴定后转化最coliBL21（DE3），IPTG诱导表达，PAGE检测。目的蛋白经Ni．NTA亲和纯化后，再用阴离子交换柱ResourceQ和分子筛柱Superdex200进行纯化。同时按包涵体复性后纯化的方案制备紧密黏附素及突变体intiminNgl6Y，将所得高纯度目的蛋白Tir-IBD适当稀释后耦联BIACore3000配套的NTA芯片，在25℃和37℃条件下分别以紧密黏附素及突变体intim．inN916Y作为流动相进行BIACore检测。结果EHEC0157：H7基因组扩增出了约270bp的目的片段；原核表达质粒pET-21a（＋）-tir-ibd经酶切及测序鉴定与设计序列一致。转化EcoliBL21（DE3）后IPTG诱导目的蛋白表达率约15％；PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量（肘，）约10x103，破菌后电泳证实目的蛋白为可溶表达。Ni-NTA亲和纯化和阴离子交换纯化效果明显，高纯度的Tir-IBD蛋白耦联NTA芯片，在25℃和37℃条件下对紧密黏附素及突变体intiminN916Y与＇Fir．IBD相互作用的BIACore检测结果显示，intiminN916Y特定氨基酸的突变对其结合能力有明显影响并呈温度依赖性。结论EHEC0157：H7的紧密黏附素、突变体intiminN916Y及Tir-IBD经基因克隆后获得了较好的表达，纯化后获得高纯度的目的蛋白。在此基础上建立了蛋白相互作用的BIACore检测体系，证明intiminN916Y特定氨基酸的突变对其结合能力有明显影响并呈温度依赖性。

cagT——幽门螺杆菌cag致病岛的“底座”

毒素相关基因致病岛(cagPAI)是幽门螺杆菌的一个IV型分泌系统,由28～30个蛋白质组成。cagT是cagPAI的一个重要结构蛋白,位于cagPAI针尖状结构的基底部,作为此IV型分泌系统的"底座",与cagY蛋白一起构成了cagPAI的结构框架。将cagT基因敲除,则cagPAI结构消失,阻断了效应分子cagA进入宿主上皮细胞和IL-8的分泌。cagT还可与其他cagPAI蛋白质相互作用,协同转运cagA进入宿主细胞,引起宿主细胞的损伤。

幽门螺杆菌双组分系统耐酸相关蛋白ArsS的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化幽门螺杆菌双组分系统耐酸相关蛋白ArsS,为深入研究其功能及其在幽门螺杆菌耐酸机制中的作用奠定基础。方法以幽门螺杆菌菌株26695基因组为模板,采用PCR法扩增ArsS基因,插入pET-22b(+)载体,构建重组原核表达质粒pET-22b(+)-ArsS,转化E.coliBL21(DE3),0.5mmol/LIPTG25℃诱导表达,并采用亲和层析与分子筛层析对重组蛋白进行纯化。结果重组原核表达质粒pET-22b(+)-ArsS经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;重组蛋白以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上;分子筛层析图谱显示,在150mmol/LNaCl条件下,目的蛋白层析效果较好,纯化后的重组蛋白纯度可达95%以上,浓度约为10mg/ml。结论已成功原核表达并纯化获得了高纯度的ArsS蛋白。