多粘菌素B拮抗内毒素的体外作用研究

目的 探讨多粘菌素B(PMB)对内毒素 (LPS)的亲合、中和能力 ,以及体外抑制LPS作用的时效和量效关系。方法 应用鲎试剂动态浊度法测定PMB对LPS的中和能力 ;应用生物传感器技术测定PMB与LipidA的亲和力 ;并测定PMB对LPS刺激的人PBMC释放TNF α、IL 6的抑制作用。结果 PMB具有较强的LPS中和能力 ,其IC50 约为 4 3 5± 0 91μmol L ;与LipidA具有很高的亲和力 ,其解离平衡数 (kineticdissociationconstant,KD) =1 11× 10 - 8mol L ;10 μg ml的PMB能够明显抑制 10 0ng mlLPS刺激的人PBMC释放TNF α、IL 6的释放 (P <0 0 5 ) ,并具有明显的量效关系 ;在LPS刺激PBMC前应用PMB ,细胞因子释放的抑制率达 95 %以上 ,但在LPS刺激后 10min ,PMB即失去了对细胞因子的抑制作用 (P >0 0 5 )。结论 PMB具有较强的内毒素结合及中和能力 。

小鼠肝脏细胞分离和原代培养技术研究进展

肝脏是机体主要的消化、代谢器官,同时也是重要的免疫器官;获得肝脏细胞[肝细胞（hepatocytes,HCs）、肝血窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells,LSECs）、肝星形细胞（hepatic stellate cells,HSCs）和枯否细胞（kupffer cells,KCs）等]并进行成功的原代培养,将有助于为研究肝脏的生物学特性（药物代谢、免疫及生理功能等）和“人工肝”工程等提供实验工具和材料；故探索和研究肝脏细胞的分离和原代培养技术具有重要意义。

人趋化因子ELC的克隆与表达

目的 克隆人趋化因子ELC基因,表达并初步纯化ELC融合蛋白。方法 从扁桃体中提取总RNA ,再进行RT PCR ,扩增ELC成熟蛋白基因,并在5′和3′分别添加NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点,通过这两个酶切位点重组于pET3 2a(+ )载体上,转化E .coliDH5α,筛选阳性克隆,酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性,缺失突变获得ELC天然蛋白表达载体pET3 2a(+ ) ELC ,SDS PAGE分析其表达,Westernblot验证融合蛋白。大量表达并初步纯化ELC融合蛋白。结果 成功克隆了ELC基因,表达并初步纯化得到ELC融合蛋白。结论 构建的ELC硫氧还蛋白融合表达载体以可溶性蛋白的方式表达ELC硫氧还蛋白。

重组趋化因子vMIP-II在大肠杆菌中的表达和纯化

目的 重组病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ (viralmacrophageinflammatoryproteinⅡ ,vMIPⅡ )在大肠杆菌中表达及纯化。方法 以pET32a(+)vMIPⅡ为重组趋化因子vMIPⅡ克隆基因的表达质粒 ,以大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS为表达菌 ,在IPTG诱导下表达出一个由 2 30个氨基酸残基组成的硫氧还蛋白 (thioredoxin)vMIPⅡ的融合蛋白 (2 6×10 3 )。经细菌裂解、金属离子螯合亲和层析、肠激酶消化以游离vMIPⅡ及阳离子交换层析等步骤纯化目的蛋白 ,以配体结合实验鉴定纯化产物的生物学活性。结果 从 1L发酵菌液中可获得高纯度目的蛋白约 4～ 6mg。配体结合实验表明 ,该产物能与CCR5结合 [Kd =(10 .90± 1.0 7)nmol/L]。结论 采用本方法可获得高表达、高纯度的具有生物学活性的重组病毒趋化因子vMIPⅡ。

2-氨基-1,2,3,4,6-O-五乙酰葡萄糖的合成

2Amino1,2,3,4,6Opentaacetyl glucopyranose was synthesized from glucosamine hydrochloride,acetic hydride and triethylamine with thick sulfur acid as a catalyst.Under optimum reaction conditions,glucosamine hydrochloride,acetic hydrideand triethylamine reacted in at 60°C for 3h to give the goal product in 852% yield.Its structure was confirmed by H1NMR and elemental analysis.

人趋化因子SLC原核表达载体的构建与表达

目的 构建趋化因子SLC(secondarylymphoid tissuechemokine)的硫氧还蛋白融合表达载体并表达融合蛋白。方法 从人扁桃体中提取总RNA ,再进行RT PCR ,扩增SLC成熟蛋白基因 ,并在 5’和 3′分别添加NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点 ,通过这两个酶切位点重组于pET3 2a( +)载体上 ,转化E .coliDH5α ,筛选阳性克隆 ,酶切鉴定 ,DNA测序检测插入序列的正确性 ,经突变删除因NcoⅠ位点引入而在肠激酶位点和目的基因间多余的 3个氨基酸 ,DNA再测序检测突变结果 ,SDS PAGE分析其表达 ,并通过金属离子亲和层析、除盐、弱阳离子交换层析 ,得到纯化的融合蛋白 ,Westernblot验证纯化的融合蛋白。结果 成功构建了SLC天然蛋白的硫氧还蛋白融合表达载体 ,表达并纯化出融合蛋白 ,Westernblot证明该融合蛋白能与羊抗人SLC一抗结合。结论 构建的天然SLC硫氧还蛋白融合表达载体以可溶性蛋白的方式稳定表达SLC硫氧还蛋白 。

金黄色葡萄球菌细胞壁可溶性肽聚糖的分离纯化和鉴定

目的从金黄色葡萄球菌中提取纯化可溶性肽聚糖并鉴定其活性。方法采用小剂量青霉素作用金黄色葡萄球菌(ATCC25923),诱导合成可溶性肽聚糖(PGN)粗品,经SephadexG-100凝胶层析进一步分离纯化;采用SLP试剂盒对纯化的可溶性PGN定性,ELISA法检测纯化的可溶性PGN对小鼠RAW264.7细胞的活化作用。结果分离纯化的可溶性PGN经SLP试剂检测阳性,该可溶性PGN可刺激RAW264.7细胞释放TNF-α,并具有明显的量效关系。结论采用青霉素诱导结合凝胶层析技术可从金黄色葡萄球菌获取纯度及生物学活性较高的可溶性PGN。