基于Smad3的抗瘢痕增生药物高通量筛选体系的构建及效果评价

目的:构建Smad3反应性不稳定增强型绿色荧光蛋白(d2EGFP)报告系统,作为抗瘢痕增生药物高通量筛选体系。方法:分别以EGFP、d2EGFP为报告基因,neor为筛选基因,构建以4×成纤维细胞α2Ⅰ型前胶原(COL1A2)基序为增强子、SV40为启动子的报告基因载体p4COL1A2-EGFP和p4COL1A2-d2EGFP,并分别稳定转染NIH3T3细胞,获得Smad3反应性报告细胞株NIH3T3-d2EGFP和NIH3T3-EGFP。分别向两种细胞株中加入TGF-β1,比较不同时相点d2EGFP和EGFP的表达。应用Smad3“圈套”寡核苷酸(TFD)转染NIH3T3-d2EGFP,加入TGF-β1,观察TFD对TGF-β1诱导d2EGFP表达的拮抗作用。结果:NIH3T3-d2EGFP是较理想的Smad3反应性报告细胞株,Smad3TFD对TGF-β1诱导调控d2EGFP的表达具有明显的拮抗作用。结论:Smad3反应性d2EGFP报告系统可特异、灵敏、动态地反映和监测Smad3的活性变化。