iASPP在p53缺失肿瘤细胞中影响细胞凋亡的机制

目的阐明iASPP在p53缺失细胞中影响细胞凋亡的机制。方法将iASPP、干扰iASPP、p63、p73、Bax-Luc和Puma-Luc等转染进H1299细胞中,观察各种情况下对前凋亡基因转录能力的影响;用体外转录/翻译偶联系统、免疫沉淀和Western blot方法研究iASPP与p63和p73在体外的相互作用;用细胞转染、免疫沉淀和Western blot方法研究iASPP与p63和p73在细胞内的相互作用。结果①H1299细胞转入iASPP后前凋亡基因Bax和Puma的转录能力下降,分别只有对照组的0.14倍和0.13倍;②H1299细胞转入iASPP干扰质粒后前凋亡基因Bax和Puma的转录能力增强,分别为对照组的3.58倍和4.14倍;③p63和p73转染H1299细胞后,前凋亡基因Bax和Puma启动子的转录能力增强,分别增加4.67倍和3.03倍(转染p63后)和5.90倍和3.36倍(转染p73后);④iASPP与p63、p73在体外和细胞内存在着相互作用;⑤干扰iASPP后p63和p73的蛋白表达水平不变。结论在p53缺失的H1299细胞中,iASPP是通过抑制p63/p73的转录因子的功能,从而影响前凋亡基因Bax、Puma等的转录活力,进而导致细胞凋亡变化的。

定点诱变法构建p53基因多态质粒

目的:为了研究p53codon72多态的功能,采用定点诱变法构建人p53基因的多态质粒。方法:设计带有突变碱基的引物,通过PCR扩增引入突变碱基,再将突变后的p53序列插入载体中,经测序确定所扩增的DNA序列,并用体外转录翻译系统制备p53蛋白和i ASPP蛋白,免疫沉淀法检测蛋白相互作用。结果:通过PCR获得的含突变碱基的p53序列经连接后插入真核表达载体pReceiver-M01中,构建了p53多态位点为72Arg的表达质粒pReceiver-M01-p53(Arg72)。测序证明序列正确,表达的p53蛋白能与i ASPP相互作用,具有生物学功能。结论:成功构建了p53多态(72Arg)真核表达载体,为进一步深入研究p53多态的生物学功能奠定了基础。

Puma荧光素酶报告基因的构建和鉴定

目的为研究p53家族调控细胞凋亡的机制，构建并鉴定插入人Puma基因的启动子片段的荧光素酶报告基因载体。方法采用PCR技术从人类HepG2细胞中扩增Puma启动子的含p53反应元件的180bpDNA片段，插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。经测序确定所扩增的DNA序列；将其转染人人类肺腺癌141299细胞中，双报告基因实验检测荧光素酶活力。结果测序结果表明扩增的Puma启动子序列正确，活性检测显示构建的报告基因具有启动子活性。结论克隆了含p53反应元件的Puma启动子，成功构建了人类Puma启动子报告基因，为p53家族凋亡通路的功能研究提供了必要的实验材料。