难愈性创面修复局部人血管内皮生长因子165真核表达载体的构建与评价

目的:克隆人血管内皮生长因子165cDNA并构建其真核表达载体,为放创复合伤的难愈性创面的促愈修复提供实验基础。方法:实验于2001-09/2003-05在第三军医大学创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。从白血病HL-60细胞提取总RNA,经过反转录-聚合酶链反应扩增编码人血管内皮生长因子165的cDNA序列,将其克隆至pMD18-T载体后进行测序鉴定,然后将该序列插入双顺反子的真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中。观察以下指标①反转录-聚合酶链反应扩增人血管内皮生长因子165cDNA。②阳性重组质粒pMD18-T-hVEGF165的筛选。③DNA测序鉴定。④阳性重组质粒pIRES2-EGFP-VEGF165的筛选。结果:反转录-聚合酶链反应扩增得到约600bp的目的DNA片段,酶切pMD18-T-hVEGF165得一与目的片段大小一致的条带,且测序分析其与GeneBank中报道的编码人血管内皮生长因子165cDNA序列完全一致。pIRES2-EGFP-hVEGF165的酶切电泳显示目的条带成功插入真核表达载体pIRES2-EGFP中。结论:成功构建了含有人血管内皮生长因子165cDNA的真核表达载体,如果通过转基因技术可提高血管内皮生长因子165在放创复合伤难愈性创面的局部的表达,有望为修复难愈创面开辟一条新的途径。