兔源内毒素结合蛋白的提取纯化及体外生物学活性研究

目的 从烧伤合并内毒素血症损伤兔的血清中分离纯化出内毒素结合蛋白 (Lipopolysaccharide BindingProteinLBP) ,以研究LBP在烧伤复合内毒素血症中的作用。方法 兔血清中蛋白质通过二步离子交换层析 (Bio Rex 70Resin、Mono Q)及凝胶过滤来分离纯化 ,并经流式细胞分析实验、绵羊红细胞凝聚实验、氨基末端氨基酸残基测序等方法鉴定 ,再将LBP作用于体外培养的人单核细胞 (U93 7) ,观测其分泌TNFα等细胞因子的状况。结果 获得一种分子量为 60× 10 3蛋白质 ,其N端 10个氨基酸序列为TNPGLITRIT ,与NCBI蛋白质库中有关兔的氨基酸序列进行比较 ,发现其与LBP的序列相同 ,它能促进脂多糖 (LipopolysaccharideLPS)与外周血单核细胞 (PBMC)结合 ,并能促进U93 7在极低浓度的LPS用下分泌TNFα。结论 从血清中分离纯化带有生物活性、全长LBP是可行的 ,LBP能促进极低浓度的LPS与单核细胞结合 ,介导炎性因子的分泌 ,从而促进炎症反应的发生。

室温保存白细胞凋亡的时相变化及分子机制初探

目的 研究室温保存下白细胞凋亡的时相变化及Bcl 2和Bax在其中的作用。方法 采用Annexin V FITC -PI双标染色 ,结合流式细胞术 (FCM)检测细胞凋亡 ;以Westernblot检测Bcl 2和Bax蛋白表达变化。结果 1～ 2 4h凋亡细胞百分数逐渐增加 ,在 2 4h时达到峰值 ;72h时凋亡细胞反而降低。随着保存时间的延长 ,坏死细胞呈由低到高的变化 ,而活细胞则越来越少。Westernblot结果显示 ,1～ 2 4hBax表达逐渐增加 ,条带越来越清晰 ;72h时表达反而降低。 1～ 72h内 ,Bcl 2表达逐渐降低。结论 室温保存下 ,白细胞逐渐凋亡坏死 ,活细胞数量逐渐减少 ;Bcl 2和Bax在调节白细胞凋亡的机制中起着重要的作用。临床应用以输用保存 3～

坐骨神经火器伤后神经元凋亡与脂质过氧化反应

目的 了解火器性周围神经损伤后神经元凋亡与脂质过氧化反应的关系。方法 采用火器性坐骨神经损伤模型 ,通过流式细胞仪检测神经损伤后脊髓细胞凋亡 ,通过丙二醛 (MDA)含量与超氧化物歧化酶 (SOD)活性检测脊髓组织的脂质过氧化反应。结果 伤后 1、3d、1、2周的凋亡细胞百分比分别为 1 4%、2 7%、7 8%、4 4% ;火器性神经损伤后 1dSOD即有明显增高 ,至 2周左右达最高峰。MDA则在伤后 2周内呈持续性增高的趋势。结论 火器性坐骨神经伤后的脂质过氧化反应是神经元凋亡的重要原因之一。

原代成纤维细胞和纤维肉瘤细胞自分泌转化生长因子β1浓度检测及对转化生长因子β1增殖的调节

背景:体外实验常采用外源性转化生长因子β1刺激来观察细胞增殖变化,易忽略细胞本身自分泌转化生长因子β1的影响。目的:检测原代成纤维细胞和纤维肉瘤细胞(L929)自分泌转化生长因子β1的浓度和细胞增殖的变化。方法:Elisa试剂盒检测原代成纤维细胞和纤维肉瘤细胞各时相点细胞内和培养上清中生长转化因子β1水平。结果与结论:纤维肉瘤细胞内转化生长因子β1浓度随培养时间延长而升高,原代成纤维细胞内转化生长因子β1浓度随培养时间延长而降低;两种细胞培养上清转化生长因子β1浓度均随时间而上升,但纤维肉瘤细胞显著高于原代成纤维细胞(P<0.01),峰值时达到原代成纤维细胞的20倍;两种细胞增殖曲线在72h内均随时间而显著增高(P<0.01),同一时间点比较,纤维肉瘤细胞明显高于原代成纤维细胞。提示自分泌转化生长因子β1具有促进细胞增殖的作用,不同的自分泌水平可能是影响原代成纤维细胞这种正常细胞和纤维肉瘤细胞肿瘤细胞对于外源转化生长因子β1反应不同的重要原因。

单细胞水平β地中海贫血诊断膜芯片检测技术的探讨

目的 对在单细胞水平 β地中海贫血诊断膜芯片检测技术进行探讨。 方法 采用 15个碱基的随机引物对单个细胞的基因组进行引物延伸预扩增 (Primerextensionpreamplification ,PEP) ,取其产物 5 μl分别对 β地中海贫血的目的基因片段进行巢式或半巢式扩增 ,然后采用反向斑点杂交 (Reversedotblot,RDB)技术检测 β地贫突变型。 结果 将这些技术应用于 4例已经确定突变基因型的 β地贫患者及 1例正常女性 ,检测结果与预料的相符。 结论 结合我们的实验结果 ,提示在单个细胞或微量DNA模板水平运用基因芯片技术进行遗传病检测是可行的 。

哮喘豚鼠肺组织中G蛋白的表达及胸腺素对其的影响

目的：研究哮喘豚鼠肺组织Ｇ蛋白α亚基含量的表达变化及胸腺素对其的影响。方法：用卵蛋白雾化吸入致敏的方法复制豚鼠哮喘模型，并用胸腺素治疗，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交分析法测定Ｇα含量。结果：哮喘组豚鼠肺组织Ｇｉα（１２６％ ±１１％ ）、Ｇｑα（１２２％ ±１２％ ）较正常对照组显著升高（Ｐ均＜ ０．０５）；而胸腺素组Ｇｉα、Ｇｑα（分别为９７％ ±９％ 和９８％ ±１１％ ）较哮喘组显著降低（Ｐ均＜ ０．０５）；胸腺素组Ｇｓα（１０７％ ±６％ 和１０４％ ±５％ ）无显著变化（Ｐ均＞ ０．０５）。结论：哮喘肺组织Ｇｉα、Ｇｑα表达增加在哮喘发病中可能占有一定地位，而胸腺素通过降低Ｇｉα、Ｇｑα在哮喘豚鼠肺组织的表达变化达到了治疗或缓解哮喘的目的。

一种适用于流式细胞术的简便红细胞裂解法

目的 探讨一种简便、快捷的红细胞列解法 ,以适宜应用流式细胞仪对白细胞亚群进行检测和分选。方法 采用常规试剂配置不同浓度应用液 ,按步骤完成红细胞裂解过程 ,上机检测。同时采用密度梯度离心法提取单核细胞和粒细胞 ,比较两者上机检测的结果。结果 在流式细胞仪检测的细胞点图上 ,可见采用红细胞裂解法处理的标本白细胞成簇分布 ,淋巴细胞、单核细胞、粒细胞群清晰可辩 ,通过测定各群细胞上标记的特异性荧光 ,可进一步分离出淋巴、单核和粒细胞的亚群 ,细胞纯化程度高。采用密度梯度离心法纯化的粒细胞或单核细胞 ,在细胞点图上可见细胞散在分布 ,不成群 ,纯化程度低。其原因可能是该方法中长时间离心、改变血液渗透压、反复离心洗涤等步骤影响了白细胞的形态结构有关。结论 本实验介绍的红细胞裂解法满足了白细胞流式细胞仪检测分选要求 ,价格低廉 ,是一种简便快捷。

简便快速的血中DNA提取纯化法

目的 为了探讨血中DNA提取纯化的简便快速的方法。方法 用TritonX 10 0同时反复破碎红细胞和白细胞 ,然后用NaClO4、SDS解聚核蛋白 ,用PCI抽提 ,SephaderG 2 5柱层析。结果 A2 60 /A2 80 可达 1.78～ 1.80 ,平均产量 2 0 .3μg/ml,全过程 2～ 3h。 结论 这种方法用于临床经济、快速、得率高 ,诊断结论可靠。

大鼠c-ski基因siRNA真核表达载体的构建及其在成纤维细胞中的干扰效果观察

目的构建大鼠c-ski基因的特异性siRNA沉默质粒,并评价其在大鼠皮肤原代成纤维中的干扰效果。方法采用pSUPER质粒构建大鼠c-ski基因siRNA的重组真核表达质粒,转染大鼠皮肤成纤维细胞,采用荧光纤维镜观察转染效率,BrdUELISA法检测转染后细胞增殖情况并作为其干扰效果的初步筛选,定量PCR、免疫组化法检测c-ski基因和蛋白的表达变化。结果构建3个c-SkisiRNA沉默质粒,按照质粒(μg)/脂质体(μl)1∶2.5的比例转染时效率最高,约为53.5%。转染c-SkisiRNA沉默质粒后,细胞增殖降低,且抑制效果与转染剂量成正比。定量PCR、免疫组化法结果显示转染后c-ski基因表达下调51%(P<0.01),蛋白表达明显降低。结论c-Ski沉默质粒构建成功,瞬时转染大鼠皮肤原代成纤维细胞后可以显著抑制c-ski基因和蛋白的表达。

脑损伤后脑脊液腺苷浓度测定方法的建立

目的建立人脑脊液中腺苷(adenosine,AD)浓度的检测方法。方法收集脑损伤后病人脑脊液,采用ODS反相C18柱检测,以50mmol/L磷酸二氢钠∶甲醇(80∶20)为流动相,流速为1.0ml/min,检测波长为254nm。结果该方法在检测0.78～15mg/L腺苷浓度有着良好的线性关系(R2=0.9981),保留时间为4.9min,平均加样回收率为(98.59±0.65)%,日内相对标准偏差小于2.46%,日间相对标准偏差小于3.56%。脑损伤病人脑脊液腺苷含量高于正常腺苷范围。结论本方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、操作简便等优点,可用于脑脊液中腺苷浓度的测定。

树脂摊片法在坐骨神经免疫电镜观察中的应用

目的 通过树脂摊片包埋在坐骨神经免疫电镜观察中的应用 ,以提高检测的阳性率及定位的准确性。方法 40只 3月龄Wistar大鼠分别用CJ Pen19灭活菌株经初次免疫和加强免疫后 ,第 5周取坐骨神经 1cm ,Zamboni液固定 6～ 18h ,石蜡包埋 ,制成 2 0 μm厚的切片 ,免疫组化检测坐骨神经局部IgG ,光镜下选取有意义的区域定标。采用树脂摊片包埋制片。 结果 轴索变性组IgG染色呈点状 ,中等电子密度沉积于神经轴膜和轴浆内 ,髓鞘脱失组IgG主要位于髓鞘表面 ,神经轴膜和轴浆均未见IgG沉积。结论 树脂摊片包埋在免疫电镜标本制作过程中 ,能明显提高检测的阳性率及定位准确性 。

人ski基因真核表达载体的构建及促细胞增殖作用

背景:c-Ski既可促进组织修复,又能降低瘢痕形成,有望成为一个全新的基因治疗药物。目的:构建人ski基因的真核表达载体,并对其促成纤维细胞增殖效果进行验证。方法:RT-PCR法从人包皮培养原代成纤维细胞总RNA中扩增出人ski基因,连同真核表达启动子CMV克隆到pUC118载体上,酶切和测序验证后,应用脂质体将其转染到培养的大鼠皮肤成纤维细胞中。结果与结论:酶切和测序结果证实表达质粒构建成功,Westernblot显示Ski蛋白在转染细胞中成功表达,且可显著提高转染细胞的增殖效应,说明以pUC118为骨架的重组ski表达质粒具有促进大鼠皮肤成纤维细胞增殖的作用。

Tau蛋白过度磷酸化的致病机制及其在创伤性脑损伤中的作用

作为微管相关蛋白的一员,Tau蛋白结合、稳定微管及其过度磷酸化时参与神经退行性疾病的机制已被广泛研究。近年来许多研究发现Tau蛋白的异常过度磷酸化状态及其神经毒性作用是部分创伤性脑损伤患者远期认知功能障碍的重要致病机制之一。本文首先总结了对Tau蛋白生理功能及其致病机制的研究进展,并结合最新研究发现分析了Tau蛋白如何参与创伤性脑损伤后远期认知功能障碍。

不同剂量软X射线照射对大鼠伤口愈合影响规律的研究

目的 研究软X射线局部照射对创伤愈合的影响规律。方法 采用大体观察、组织病理学、免疫组化 (胶原染色 )和图像分析等方法 ,动态观察不同剂量软X线局部照射后大鼠伤口愈合的过程。结果 0 5 0、1 0 1、1 96、3 2 6、4 0 0、5 2 1Gy组照射侧的创面愈合时间比对照侧分别延长了 1 6、4 2、5 4、6 6、8 2、9 4d ,7 0及 10 0Gy组则创面不愈 (>40d)。各组的已愈创面百分率在 3～ 9d之间的变化幅度均比对照侧小 ,随着照射剂量的增大 ,变化的幅度亦减小 ,表明创面愈合速度减慢。照射后伤口组织胶原的合成降低 ,排列紊乱 ,肉芽组织的结构不规则。结论 局部软X线照射后 ,大鼠伤口愈合延迟 ,在 0 5 0～ 5 2 1Gy之间延迟时间随照射剂量的增大而延长。

以Rho／ROCK为靶点治疗创伤性脊髓损伤的研究进展

创伤性脊髓损伤指机械外力作用而非肿瘤、结核、发育等因素造成的脊髓损害，包括原发性和继发性损伤，前者由机械力直接导致，不可逆转；而后者是由原发损伤造成的炎症、水肿、兴奋性毒性、氧化应激等系列级联反应，是决定损伤程度和预后的关键，且可以预防和逆转。目前，脊髓损伤治疗药物主要是针对各类继发性损伤，在这些药物中，针对小G蛋白Rho及其激酶ROCK的药物显示出良好的临床应用前景。笔者拟综述Rho／ROCK信号通路在创伤性脊髓损伤中的作用机制及以其为靶点的治疗研究进展。

5.21Gy软X射线局部照射伤口后组织细胞周期时相变化的研究

目的 研究软X射线局部照射后大鼠伤口组织细胞周期的时相变化。方法 PI染色 ,流式细胞术 (FCM)检测细胞周期 ;BrdU掺入后采用SABC染色检测细胞增殖。结果 在伤后 3～9d ,对照侧G0 G1 期细胞逐渐减少 ,S期细胞增加 ,9d时达到峰值 ;G2 M期细胞增加 ,15d时达到峰值。照射侧G0 G1 期细胞增加 ,S期和G2 M期细胞减少。在伤后 12～ 2 2d ,照射侧S期细胞逐渐增加 ,2 2d时达到峰值 ,大量的细胞停留在S期。在整个愈合过程中 ,G2 M期细胞百分数均低于对照侧。BrdU掺入SABC染色阳性细胞主要为成纤维母细胞、血管内皮细胞以及平滑肌细胞。结论 5 2 1Gy软X射线局部照射后 ,细胞发生G1 期阻滞和S期延长 ,G2 M转换障碍 ,细胞分裂增殖受抑 ,创伤愈合延迟与细胞周期的紊乱有关 ,G1 期阻滞和S期延长越严重 ,愈合延长时间越长。

小鼠颅脑创伤急性期腺苷A2A受体对垂体-肾上腺轴应激反应的影响

目的研究腺苷A2A受体在中度颅脑创伤急性期垂体-肾上腺轴应激反应中的作用。方法将野生型、基因敲除小鼠各18只按随机数字表法分别分为正常对照组、伤后4，24h组，每组6只。使用腺苷A2A受体基因敲除小鼠和野生型C57BL／6小鼠复制颅脑创伤模型，ELISA法测定伤后4h和24h血浆中促肾上腺皮质激素（adrenoeorticotropichormone，ACTH）和皮质酮浓度。结果野生型伤后4，24h组脑含水量分别为（80．950±0．184）％、（82．178±0．255）％，基因敲除伤后4，24h组脑含水量分别为（80．006±0．199）％、（81．091±0．295）％，均高于各自对应的正常对照组（P〈0．01），且野生型损伤组脑含水量高于基因敲除损伤组（P〈0．01）。基因敲除正常对照组血浆ACTH浓度为（120．2144-2．472）ng／L，皮质酮浓度为（27．814±0．888）μg/L，均高于野生型正常对照组（91．767±7．395）ng／L和（11．430±0．644）μg/L（P〈0．01）。基因敲除损伤组血浆ACTH浓度4h为（174．776±5．040）ng／L，24h为（189．613±4．802）ng／L；皮质酮浓度4h为（40．138±0．805）μg/L，24h为（37．440±0．485）μg/L。野生型损伤组血浆ACTH浓度4h为（119．594±6．945）ng／L，24h为（124．93±11．0017）ng／L；皮质酮浓度4h为（19．702±0．804）μg/L，24h为（17．602±0．743）μg/L，基因敲除损伤组增高幅度显著高于野生型损伤组（P〈0．05）。结论敲除腺苷A2A受体在中度颅脑创伤急性期可增加ACTH和皮质酮释放，对垂体一肾上腺轴应激反应有促进作用，为敲除A2A受体发挥神经保护作用提供了新的解释。