人间充质干细胞体外成骨诱导培养及其生物学特性变化

目的 确定人间充质干细胞 (MSCS)体外扩增培养、向成骨细胞表型转化的方法 ,了解其生物学特性变化。方法 分离人骨髓细胞 ,按不同种植密度、首次换液时间进行原代培养 ,对传代培养细胞用化学药物或生长因子进行成骨诱导培养 ,并检测成骨细胞表型、生长曲线、贴壁率。结果 人MSCS 原代培养种植细胞密度为 1× 10 5～ 3× 10 5/cm2 ,48h后半量换液 ,以后每 3d全量换液的方法较合理。经化学药物 (如地塞米松、β 甘油磷酸、维生素C)或生长因子 (rh BMP2 、BMPS)作用后 ,MSCS 表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和骨钙素 ,细胞增殖速度减慢 ,贴壁率略降低。未诱导MSCS 形成细胞团后 ,可自动分化表达碱性磷酸酶活性。结论 合理的人MSCS 培养方法及可靠的诱导条件 ,可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。

大剂量糖皮质激素诱导兔股骨头坏死的研究

目的 :采用大剂量糖皮质激素诱导实验性股骨头坏死 ,观察用糖皮质激素过程中和停药后股骨头的变化。方法 :给家兔注射 2 5mg·kg-1·d-1的地塞米松 ,光镜、透射电镜和X线摄片观察股骨头的病理变化过程。结果 :① 4周光镜下股骨头国软下区出现典型骨坏死灶 ,且随时间的延长而加重。 8周软骨下区平均骨陷窝空虚率达 ( 5 1 8± 11 7) %,骨髓坏死广泛。停药后骨坏死程度加重 ,6周骨陷窝空虚率为 ( 72 9±11 4) %;负重区新骨形成少。②电镜下见骨细胞经历了变性、坏死、溶解的病理过程。③ 6～ 8周X线片示股骨头出现不规则透亮区 ,停药 6周仍存在且伴周围骨质硬化。结论 :大剂量糖皮质激素可直接导致股骨头坏死 ,停药后骨坏死病程仍继续发展 ;负重区骨修复能力差可能是股骨头坏死塌陷的重要病理基础之一 ;地塞米松诱导的兔股骨头坏死反映了该病的基本病变特征和病理过程。

新型点状接触动力加压接骨板的研制(生物力学部分)

目的:研制一种可对骨折断端动力加压的点状接触接骨板,对其加压特性及固定的力学稳定性进行评价。方法:使用测加压力装置,比较一颗螺钉动力位加压时动力加压钢板及点状接触动力加压接骨板的加压力。使用山羊新鲜配对胫骨20对,做成横断骨折模型,分别用DCP及PC-DCP加压固定和骨折断端存在3mm间隙情况下固定,在多功能力学试验机上进行四点弯曲实验及扭转实验。结果:PC-DCP与DCP之间加压力无显著性差异(p>0.05)。PC-DCP固定的抗弯刚度稍大于DCP,抗扭刚度较DCP稍降低,但两者之间差异均无显著性(p>0.05)。结论:PC-DCP可对骨折断端有效加压,具有与DCP相似的力学稳定性。

关节软骨组织工程种子细胞的优化获取

目的 优化关节软骨组织工程种子细胞的体外获取方法。方法 分析不同代次体外单层培养幼兔关节软骨细胞接种密度与相对接种存活率的关系 ,并观察其细胞生长状况、形态特征及分化功能。结果 相同培养条件下 ,体外单层培养关节软骨细胞的相对接种存活率和生长活性与其接种密度呈正相关 ;同一代次适宜密度 [( 2～ 3)× 10 4 cm2 ]接种者的相对接种存活率和生长活性同高密度 [( 4～ 5 )× 10 4 cm2 ]接种者相近 ;传代培养 (第 2～ 4代 )细胞的相对接种存活率和生长活性相对高于原代培养者。结论 在相同培养条件下及一定传代次数内 ,适宜密度接种进行关节软骨细胞单层传代培养 ,可获取数量多。

不同年龄人骨髓间充质干细胞体外增殖及成骨分化的研究

目的 :观测年龄对人骨髓间充质干细胞 (humanmesenchymalstemcells ,hMSCs)体外增殖、成骨分化的影响。方法 :使用密度梯度离心法分离不同年龄人骨髓MSCs进行培养 ,保留贴壁细胞传代 ,观察细胞生长情况 ,检测其增殖活性、碱性磷酸酶活性 (ALP)、诱导后骨钙素定量测定。结果 :低龄hMSCs较高龄hMSCs体外生长快、MTT、ALP及骨钙素浓度高。结论 :hMSCs的增殖和成骨分化的能力和活性随着年龄的增加而降低。

BMP及TGF-β复合生物材料治疗股骨头坏死的组织学观察

目的 观察吸附有BMP 2和TGF β1的PLLA/CPPf多孔材料植入股骨头坏死 (Femurheadnecrosis ,FHN)病灶清除区后的组织学变化 ,评价其诱导成骨活性及生物降解性 ,以探索FHN治疗的新方法。方法 在激素诱导性兔FHN模型上行坏死病灶清除术 ,以该种材料充填骨腔 ,行大体和组织学光镜观察。结果 ①大体观察 ,术后 2周充填区周边出现反应带 ;6周周边反应带基本消失 ,有骨小梁长入充填区 ;12周骨小梁已布满充填区。②光镜观察 ,术后 1周充填区周围间充质细胞大量增生 ,纤维肉芽组织形成 ,开始且持续呈网状长入充填区 ;2周周边有新骨产生 ,以后不断增加并向充填区中心延伸 ,材料逐渐降解 ,12周充填区广布相对较成熟的骨小梁。结论 PLLA/CPPf多孔隙材料是生长因子的良好吸附载体 ,具有较好的生物相容性和生物可降解性 ,适合活组织长入。吸附有BMP 2和TGF β1的PLLA/CPPf多孔隙材料具有较强的诱导成骨能力 ,能有效地提高在骨坏死病理条件下股骨头的骨修复能力。

新型骨与软骨组织工程支架材料制备及其性能研究

目的 研制符合骨与软骨组织工程制备技术要求的新型支架复合材料 ;并确定其性能与结构优化设计的主要参数指标。方法 按不同CPPf(聚磷酸钙纤维 ) /PLLA(L 聚乳酸 )重量比及相同CPPf +PLLA/NaCl颗粒重量比 ,采用溶铸颗粒沥取 (Solvent castingparticulte leaching)法制备系列CPPf/PLLA支架复合材料 ;液体置换法、压缩性能测试及扫描电子显微镜观测其密度、孔隙度、压缩模量及微结构特征 ;材料样品体外人工降解液直接浸渍法判定其生物降解性能 ,并观测其生物降解率、压缩模量及微结构改变。结果 系列支架材料密度为 0 10 8～ 0 16 5g/cm3 ,孔隙度 87 17%～ 93 2 4% ,压缩模量为 5 19～ 7 89MP ,横截面微结构由微孔海绵状过渡为纤维网状。随着支架材料在人工降解液中降解时间的延长 ,其降解率以 0 %～ 13 2 %线性递增 ;压缩模量呈线性降低至 1 10～ 2 78MP ;材料横截面微结构则发生相应改变。结论 CPPf/PLLA支架复合材料具有高孔隙度的三维立体结构 ,良好的抗压缩性能和生物降解性能 ,经进一步优化设计后 ,可成为结构和性能符合各项要求的新型骨与软骨组织工程支架材料。

兔骨髓基质细胞在诱导条件下的成骨特性

目的 观察兔骨髓基质细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法 使用密度梯度离心分离兔骨髓基质细胞进行培养 ,保留贴壁细胞传代 ,观察在培养液中添加地塞米松、维生素C、β 甘油磷酸钠条件下骨髓基质细胞生长及成骨分化情况。结果 骨髓基质细胞呈成纤维细胞样表现 ,增殖能力强。诱导条件下第 2代细胞的碱性磷酸酶活性明显增高 ,10～ 12d达到最高峰 ,并且出现矿化结节。结论 使用本实验方法 ,获得的骨髓基质细胞成骨能力肯定 ,增殖能力强 ,可作为骨组织工程的种子细胞。

高数量骺板软骨细胞聚集培养生成软骨组织的观察

目的 观察高数量骺板软骨细胞的离心管内长期聚集培养生成软骨组织的大小和生物学特点 ,并对这一培养技术进行初步评价。方法 酶消化法分离幼兔骺板软骨细胞 ,以 90× 10 4 原代细胞经离心沉降于 15ml塑料离心管底聚集培养 ,行大体、倒置显微镜以及组织学、Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组化光镜观察。结果 培养生成的软骨 ,随培养时间的延长体积逐渐增大 ,4周时直径最大为 4 5mm ;外周组织结构类似于骺软骨的生发层或软骨膜 ,由多层细胞构成 ,随时间的延长而减少 ;中心部位为肥大的软骨细胞 ,随培养时间的延长而增多。 2周后 ,甲苯胺蓝染色呈强的异染反应 ,Ⅱ型胶原免疫组化呈强阳性 ;Ⅰ型胶原的免疫组化着色明显减弱 ,主要位于外周。结论 离心管内工程化软骨构建技术所需操作简便、设备简单 ,生成的工程化骺板软骨具有良好的软骨结构和富含软骨特异性基质成分 ,增加细胞数量可使形成的软骨体积有所增大 ,但其大小和形状仍很有限。

经离心管培养骺软骨异体修复兔骺板部分损伤的初步观察

目的 初步观察经离心管培养生成的骺软骨异体修复兔胫骨骺板部分损伤。方法 酶消化法分离骺板软骨细胞 ,以90万细胞离心沉降于 15ml塑料离心管底 ,培养生成骺软骨组织 ,大体、倒置显微镜、组织学观察 ;异体移植修复兔胫骨内侧骺板部分损伤模型 ,X线摄片、组织学大体和光镜观察。结果 ①离心管内生成的骺软骨外周组织结构类似于骺软骨的生发层 ,由多层细胞构成 ,培养 3周时有 6～ 8层细胞 ,随时间的延长而减少 ;中心部位为肥大的细胞 ,随培养时间的延长而增多。②X线片示实验组胫骨内翻和短缩畸形轻微 ,而对照组畸形严重。实验组 2周骺板缺损充填区形成比骺板宽的新软骨组织 ,近骨端侧及中心部结构较紊乱 ,远骨端侧的组织结构与骺板相同 ;4周时已改建成了良好的骺板结构 ,生发层比正常骺板宽 ,与未损伤区分界清楚 ,为薄层软骨膜样组织相隔。对照组骺板缺损区有广泛的骨桥形成 ,4周时骨端变形严重。结论 应用组织工程技术从组织结构和功能上修复骺板损伤是可行的 ;离心管内骺软骨培养 3周是植入体内的较佳时机 ;体外培养生成的骺软骨组织在骺板缺损区的生理环境作用下可以改建为具有良好定向生长功能的骺板结构。

骺板软骨细胞复合三维支架体外构建组织工程软骨的研究

目的 探讨将骺板软骨细胞复合三维支架经体外培养 ,构建组织工程软骨的效果及其生物学特点。 方法 将 3周龄幼兔第 1代骺板软骨细胞与液态的生物凝胶混合 ,接种于聚磷酸钙纤维 /L -聚乳酸 (CPPF/PL L A)三维支架材料 ,构建组织工程软骨组织块 ,连续培养 4周。行大体、倒置显微镜及组织学、 型和 型胶原免疫组织化学光镜观察 ,定量检测硫酸糖胺多糖 (GAG)含量。 结果 构建的组织工程软骨块在培养过程中能保持其初始外形 ,种子细胞呈稳定的三维均相分布 ,外观逐渐呈乳白色、半透明 ,硬度亦不断增加。培养 1周有软骨细胞陷窝形成 ,2周后形成富含 型胶原和蛋白聚糖、具有典型软骨组织结构的工程化软骨 ,且 型胶原逐渐转为阴性。 4周时构建软骨的组织结构与天然骺板软骨相类似 ,硫酸 GAG含量平均为天然骺板软骨的 34%以上。 结论 骺板软骨细胞复合三维支架体外培养可生成典型软骨 ,且可形成类似天然骺板软骨的组织结构 ,能满足修复骺板缺损的基本要求。体外培养 1～ 2周可能是植入体内修复骺板缺损的较佳时机。

海藻酸盐控释微球的制备及其体外释药特性

研制白蛋白海藻酸钠(BSA-海藻酸钙微球)控释微球,并对其体外释药特性等进行考察,为应力控释VEGF促进组织工程骨血管化提供理论依据。以海藻酸钠为载体,采用W/O乳化-离子交联法制备BSA-海藻酸钙微球;检测粒径大小、外观、包封率等理化特性;考察微球的体外释药特性。微球球形圆整,分散性好,平均粒径为230±60μm,载药量达80.3μg/mg,包封率为61%;微球的体外释药速率平稳,周期达2周余。海藻酸钠可以作为蛋白、多肽类药物的可生物降解辅料;乳化离子交联法的制备工艺简便,有利于蛋白、多肽类药物结构和功能的稳定性并有效延长其作用时间。

BMP诱导成骨过程中胶原生成及TGF-β_1的促进作用

目的 探讨骨形态发生蛋白 (Bonemorphogeneticprotein ,BMP)诱导成骨过程中骨胶原氨基酸的变化规律及转化生长因子 β1(Transforminggrowthfactorβ1,TGF β1)对骨胶原生成的影响 ,进一步阐明BMP的诱导成骨机制和TGF β1对骨损伤修复的调节机制。方法 实验采用日本大耳白兔左尺骨中上段 12mm骨缺损实验模型 ,随机分为实验组、对照组及空白组 ,缺损内分别植入BMP/TGF β1/载体、BMP/载体及单纯载体。分别于术后第 1、2、3、4、5周检测各组缺损区胶原羟脯氨酸 (Hydroxyproline ,HP)及羟赖氨酸(Hydroxylysine ,HL)量的变化 ,并作胶原VG染色图像分析、组织学及电镜观察。结果 实验组较同期对照组及空白组胶原HP生成量增加 ,成骨细胞数量增多 ,Ⅰ型胶原生成时间提前、生成量增加 ,胶原总量也明显增加 ,骨损伤修复时间缩短。结论 TGF β1可使骨胶原在BMP诱导成骨过程中生成增加。TGF β1通过促进成骨细胞生成使Ⅰ型胶原分泌能力增强 ,并抑制Ⅱ型胶原产生使软骨期缩短 ,骨损伤修复提前。BMP、TGF β1两者在骨损伤修复中相互加强 ,具有协同作用。

仿生脉冲电磁场对OVX-OP大鼠骨密度与生物力学相关关系的影响

目的骨密度与骨的生物力学性能存在相关性,但某些治疗方法对骨密度及骨折发生率的影响并不一致,表明不同治疗方法可能对骨密度与骨的生物力学性能间的相关关系存在不同的影响。为此,本研究观察了仿生脉冲电磁场对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度与生物力学关系的影响,并与雌激素进行了比较。方法6月龄雌性未孕Wistar大鼠160只,按体质量随机抽取分为以下4组去卵巢组(OVX),去卵巢+苯甲酸雌二醇组(E),假手术组(Sham),电磁场治疗组(EM)。OVX、EM、E组行双侧卵巢切除术,Sham组行假手术。术后第9W开始治疗E组苯甲酸雌二醇肌肉注射,0.5mg/kg,1次/2W。EM组大鼠暴露于仿生脉冲电磁场治疗,1h/1次/d,OVX、Sham组不予以任何处理,作为对照组。开始治疗后6W、8W、10W、12W等时间点分别在麻醉下处死实验动物,腰6椎体、右侧股骨应用DEXA测定骨密度,并进行腰6椎体、右侧股骨生物力学指标的测定。结果股骨BMD(bonemineraldensityBMD)与最大载荷、腰6椎体BMD与最大载荷之间均存在一种正向的线性关系。在股骨中,OVX较组相关曲线较Sham组相关曲线向右下方平移,E组则平移不明显,EM组则有左上方平移。在腰6椎体中,OVX、E组相关曲线向右下方平移不明显,EM组有左上方平移。结论仿生脉冲电磁场不但具有提高OVX-OP大鼠的BMD,同时改善了骨密度与生物力学性能的相关关系。

缓慢牵伸肢体延长周围神经亚临床损害修复过程的观察

目的 探讨肢体缓慢牵伸延长周围神经亚临床损伤的自然修复过程。方法 6 2只日本大耳白兔胫骨延长至 40 % ,停止延长后 2周、4周、8周时观察胫神经损伤自然修复的组织学及感觉诱发电位 (CSEP)的改变。结果 延长 40 %时 ,可见广泛的节段性脱髓鞘 ,朗飞氏结区增宽 ,且主要发生于大的有髓神经纤维 ;电镜下可见髓鞘呈双环状 ,空泡状改变及环形小体形成压迫轴突 ;并可见新形成的髓鞘 ;停止延长后随着时间的延长 ,这种改变逐渐修复 ;至 8周时基本恢复正常。肢体延长造成了胫后神经明显的电生理损害 ,且随着延长幅度的增加而加剧。停止延长后 2周 ,CSEP的潜伏期恢复约 5 0 %。停止延长 4周恢复约 6 5 % ,峰值、面积亦恢复约 5 0 %。停止延长 8周 ,各项指标均恢复 95 %以上。结论 缓慢牵伸下肢延长过程中周围神经的损害是可逆的 。

组织工程化关节软骨细胞凋亡的研究

目的 观察离心管构建的组织工程软骨细胞凋亡及细胞增殖情况。方法 对离心管构建 3周的组织工程软骨进行透射电镜、流式细胞仪检测和3 H TdR掺入测定 ,与 3周龄兔关节软骨对照。结果 透射电镜检查组织工程软骨有 5 %左右的细胞凋亡 ,正常关节软骨未见明显的细胞凋亡 ;流式细胞仪显示软骨细胞有 8.5 %左右的亚二倍体细胞 ,正常关节软骨有 2 .4%左右的亚二倍体细胞。3 H TdR掺入测定显示细胞增殖能力较正常关节软骨明显增强。结论 培养 3周的组织工程软骨细胞凋亡与细胞增殖均较正常软骨增强。