兔阴囊原位构建组织工程化睾丸假体的实验研究

目的探讨以HDPE-PGA复合支架接种兔耳软骨细胞后,于兔阴囊原位内构建组织工程化睾丸假体的可能性。方法取成年兔耳软骨分离培养软骨细胞,制备HDPE-PGA复合支架,细胞-支架复合物体外培养2w。摘除单侧兔睾丸后即时将经体外培养的细胞-支架复合物植入阴囊原位,术后3m将兔处死取材。单纯支架植入为对照组。标本行大体观察、组织学、组织化学、免疫组化、GAG含量检测。结果实验组取材标本经检测具有预制形态与体积,有新生软骨组织产生,软骨组织呈岛状分布,其间有不同程度的纤维组织长入及炎性细胞浸润。对照组无软骨形成。结论兔阴囊原位内构建组织工程化睾丸假体具有预制形态与体积、结构与组织学形态良好。

基于静电纺丝人脐带华通胶构建组织工程软骨的实验研究

目的探索人脐带华通胶静电纺丝纳米纤维膜的制备及其作为软骨组织工程支架的可行性。方法人脐带华通胶经脱细胞处理后,与聚己内酯(PCL)共混制备成静电纺丝纳米纤维膜。取兔耳软骨细胞接种于该纤维膜支架,体外培养验证其细胞相容性;随后植入裸鼠体内培养,6周后行组织学检测,验证其体内成软骨的可行性。结果华通胶经脱细胞处理后去除了细胞成分,且保留了绝大部分胶原。华通胶/PCL混合后成功制备出多孔结构的纳米纤维膜。活死细胞染色和CCK-8细胞增殖曲线证实,该纤维膜具有良好的细胞相容性。体内培养6周后取材,组织学证实该纤维膜复合软骨细胞可再生成熟的软骨组织。结论人脐带华通胶可通过静电纺丝技术,制备成适用于软骨组织工程的支架材料。

基于鸡蛋清制备的多孔支架用于组织工程软骨构建的实验研究

目的探究鸡蛋清制备多孔支架用于组织工程软骨构建的可行性。方法将鸡蛋清与去离子水以不同体积比(1:0、1:1和1:2)混合,通过冷冻干燥制备成多孔支架,行大体观、孔隙率及力学性能检测。取兔耳软骨细胞接种于不同体积比支架,于体外培养1 d、4 d、7 d后进行细胞染色和细胞增殖实验;体外培养至3周后,行组织学检测,观察其成软骨情况。结果三种不同体积比的蛋清均能制备成多孔结构的支架材料。随着去离子水比例的增加,其孔径大小明显提高,但是力学强度却呈下降趋势。活死细胞染色及细胞增殖实验证明,细胞可以在支架上黏附、增殖。延长体外培养时间至3周,HE染色显示三组蛋清支架上均有稚嫩的新生软骨基质形成,证实蛋清支架体外构建软骨的可行性。值得注意的是,随着去离子水比例的增加,残余的支架材料减少,新生软骨基质成分增多。结论基于鸡蛋清制备的多孔支架适合用于组织工程软骨构建。

人脂肪来源细胞体内构建组织工程化脂肪的实验研究

目的探讨以组织工程技术,应用脂肪来源细胞(Adipose-derived cells,ADCs)体内构建脂肪组织的可行性。方法吸脂术获得人脂肪组织,一部分直接植入裸鼠体内;另一部分用酶消化法分离、培养ADCs,将第三代细胞接种于纤维凝胶(Fibrin glue)支架中,经成脂肪培养液诱导1周后,植入裸鼠体内,4周后取材,用称重法及油红、HE染色检测结果。实验分为直接注射脂肪组、单纯支架组、细胞-支架复合体脂肪诱导组、非诱导组。结果直接注射组在裸鼠皮下形成脂肪组织,但吸收量大;细胞-支架复合体诱导组有大量脂肪类组织形成,油红染色显示组织有脂滴形成;细胞-支架复合体非诱导组和单纯支架组均未发现脂肪组织形成。结论采用组织工程技术将吸脂术获得脂肪来源细胞接种纤维凝胶支架,体内构建脂肪组织,具有可行性。

组织工程研究进展

各种原因导致的组织、器官缺损或功能障碍是危害人类健康的主要原因,组织、器官缺损的修复和功能重建是医学领域面临的挑战。组织工程学的建立和发展,改变了传统的"以创伤修复创伤"的组织移植治疗模式。从人体获取少量自体组织,提取种子细胞并经过体外扩增后种植到支架材料上,经过体外培养形成工程化组织后再植入体内,修复相关组织缺损并恢复原有功能。这样的组织再生模式可以真正实现无创或微创的组织器官再生和功能重建。围绕种子细胞、生物材料、组织构建等组织工程基本要素,以组织构建为核心,开展了包括骨、软骨、肌腱等多种组织构建和大动物组织缺损修复的研究,取得了一系列重要进展,并成功开展了组织工程骨的小规模临床应用。这些研究成果,证实了组织工程的广阔应用前景,奠定了向临床应用的基础。该成果于2008年荣获国家科技发明二等奖。

组织工程化血管构建中胚胎干细胞诱导分化为血管内皮细胞的研究进展

血管组织工程学是将体外培养扩增的血管壁细胞（包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细饱），种植于天然或人工合成的细胞外基质上，经体外培养后，再移植到体内，以替代病损的血管组织。而长久以来限制工程化组织研究的一个关键问题是种子细胞的来源的问题．胚胎干细胞的研究深入为体外构建各种组织提供了新的来源。同时，随着研究的深入，胚胎干细胞也有望成为组织工程化血管构建的种子细胞来源。

应用GFP标记技术示踪裸鼠体内组织工程化骨的形成

目的 应用绿色荧光蛋白(GFP)标记技术,观察组织工程化骨体内形成过程中种子细胞的变化与转归。方法 用GFP重组逆转录病毒载体(GFP-RV)转染犬骨髓基质干细胞(BMSCs),将其接种于β-磷酸三钙(β-TCP),形成细胞一材料复合物,移植于裸鼠皮下。术后8周,HE染色观察组织结构,碱性磷酸酶(AKP)染色和骨钙素(OCN)免疫组化检测功能蛋白,激光共聚焦显微镜下对GFP进行示踪观察。结果 8周后,大体可见组织工程化新骨形成,组织学示新生骨小梁围绕材料孔隙生成,AKP染色和OCN免疫组化结果阳性,并可见新生组织内有呈绿色的GFP标记细胞,β-TCP部分降解。结论组织工程化骨组织学结构与松质骨小梁类似。新生组织表达GFP,证实组织工程化骨组织的形成来源于供体细胞。

激光打孔脱细胞基质复合骨髓间充质干细胞构建组织工程气管软骨

目的探索激光打孔脱细胞基质诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)于动物体内构建组织工程气管软骨的可行性。方法应用激光打孔联合脱细胞技术制备激光打孔脱细胞基质(LDTM)作为支架材料。抽取兔骨髓,分离培养BMSCs,接种于LDTM支架后植入兔皮下。体内培养12周后,行大体观察、组织学检测、生物力学及生物化学定量检测。结果细胞均匀分布在激光微孔和支架表面,并且该复合物能够较好地维持原始的管状结构,形成了富有弹性的瓷白色软骨样组织。HE染色可见典型的软骨陷窝出现,说明成熟软骨组织形成。Safranin-O染色证实有蛋白聚糖基质产生。生物力学和生物化学检测显示新生气管组织均接近正常气管组织。结论 LDTM可以促进软骨再生并在动物体内诱导BMSCs构建组织工程气管软骨。

骨髓间充质干细胞体外构建组织工程化半月板

目的探索以骨髓间充质干细胞(BMSCs)为种子细胞,在体外构建具有完整内侧半月板形态的软骨样组织的方法。方法运用模具制备内侧半月板形的PGA/PLA支架。抽取犬骨髓,分离培养BMSCs,将其接种于支架材料上,5 d后使用软骨诱导液培养。体外培养6周后,行大体观察、组织学检测及生物力学检测。结果细胞材料复合物能够较好地维持半月板三维立体结构,形成了表面光滑、触之有弹性的瓷白色软骨样组织。HE染色可见典型的软骨陷窝出现,说明成熟软骨组织的形成。Safranine O染色证实有蛋白聚糖基质产生。生物力学检测显示,新生组织弹性模量达正常半月板组织的12.7%。结论 BMSCs通过体外诱导,可在体外分化为较成熟的软骨组织,并构建出组织工程化半月板。

骨髓基质细胞修复颅骨缺损的实验研究

目的为验证三维打印研究中动物模型的可靠性,采用骨髓基质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)修复裸鼠颅骨缺损。方法共10只裸鼠,其中实验组(n=5只):颅骨缺损区植入BMSCs/脱钙骨;材料对照组:颅骨缺损区植入单纯脱钙骨,采用实验组自身对照(n=5只);空白对照组(n=5只):双侧颅骨区造成缺损后旷置。术后3个月取材进行大体观察、组织学和免疫组化(骨钙蛋白)检查。结果术后3个月,实验侧组织质地较硬,组织学表现为骨结构,骨钙蛋白免疫组化阳性;对照侧质地较软,组织学表现为结缔组织,骨钙蛋白免疫组化阴性;空白对照组仍表现为颅骨缺损。结论采用BMSCs可修复裸鼠颅骨缺损,验证了三维打印研究中动物模型的可靠性。

软骨细胞膜片修复山羊气管的实验研究

目的探讨软骨细胞膜片技术构建的组织工程软骨,修复大型哺乳动物气管缺损的方法。方法取6头山羊耳廓软骨细胞为种子细胞,利用细胞膜片技术构建软骨组织。膜片体外培养6周,回植到动物腹部皮下;3例在皮下埋置8周后包裹于硅胶管上,移植到颈旁进行再血管化和塑形,8周后带肌肉蒂修复气道缺损(带蒂移植组);另3例在皮下埋置16周后,直接用于气道缺损修复(游离移植组)。动物气管缺损范围均为3个气管环长的全段缺损。结果所有膜片在体外培养6周后,均能形成较为成熟的软骨样组织。带蒂移植组在皮下埋置8周后能形成成熟软骨组织,移植到颈旁肌肉能成功再血管化和塑形。气管缺损修复术后,带蒂移植组均能带T型管长期存活(14周),但拔出T型管后均在2周内死亡。取材时发现,带蒂移植组修复段组织工程软骨仍然存活,并在相应部位维持了很好的管壁外形,但是没有软骨外壁的部位发生明显塌陷;内壁结缔组织增生严重,阻塞管腔。游离移植组在皮下埋置16周后,也形成了成熟软骨组织。移植修复后,在T型管存在的情况下,均在术后2周内死亡。取材发现,修复段气道均发生了严重的组织坏死感染,并波及周边组织;组织学观察仅能发现少数散在的组织工程软骨组织。结论软骨细胞膜片技术是稳定可靠的组织工程软骨构建方法;在气道复杂环境中,游离移植的软骨补片会在短时间内发生坏死;带蒂移植能保证修复段组织的存活,但是完整的软骨外壁和内壁提前(或尽快)上皮化是修复成功的关键。

小鼠毛囊来源间充质干细胞体外诱导成骨的实验研究

目的:探索便捷而有效的小鼠毛囊来源间充质干细胞的体外培养方法,并研究该群细胞的成骨能力,以探寻新的骨组织工程种子细胞。方法:采用酶消化法分离获得小鼠毛囊来源的干细胞,用不同培养体系进行传代培养,观察各细胞的增殖能力,并对所获得的毛囊来源的干细胞向成骨细胞诱导,行碱性磷酸酶染色、茜素红染色,对该细胞的成骨能力进行鉴定。结果:应用MEF条件培养液培养的小鼠毛囊来源的间充质干细胞具有较强的增殖能力,且诱导组和对照组能在体外被诱导成骨。结论:小鼠毛囊中存在具有较强增殖能力及成骨能力的间充质干细胞,可作为骨组织工程的种子细胞。

bFGF对hBMSCs增殖及成软骨能力影响的实验研究

目的探索碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖和成软骨能力的影响,并确定适用于hBMSCs体外软骨构建的细胞代次。方法获取hBMSCs,分别用DMEM和DMEM+bFGF培养基进行培养。两组细胞均传代至第4代,比较两组各代次hBMSCs的形态变化、细胞得率;取第3代细胞,用pellet法体外成软骨诱导培养3周,观察两组pellet大体观并进行Ⅱ型胶原染色。在上述实验基础上,取hBMSCs用DMEM+bFGF培养基进行培养,1∶3传代培养至第8代,观察各代次细胞的形态变化;对各代次pellet体外成软骨诱导培养3周后,行大体观察并进行Ⅱ型胶原染色。结果 DMEM+bFGF培养体系下的细胞形态、细胞得率及成软骨能力等方面均优于DMEM组。DMEM+bFGF培养体系下,按照1∶3传代的细胞传至第6代仍能维持较好的细胞形态;第1~4代细胞均表达软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原,第5及后续代次的细胞成软骨能力较差。结论 bFGF可明显促进hBMSCs增殖,并可更好地维持hBMSCs的成软骨能力,在该培养体系下的第1~4代细胞适用于体外软骨构建。

不同体外诱导时间对BMSCs成软骨分化的组织学特性影响的研究

目的探索体外不同时间的成软骨诱导,对骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外成软骨分化的组织学特性的影响。方法以猪第2代BMSCs为种子细胞,以聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)为支架,体外构建直径12 mm,厚3 mm的圆盘状复合物,联合应用TGF-β1(10 ng/mL)、IGF-I(50 ng/mL)及地塞米松(40 ng/mL),体外分别诱导1周和4周,并以未经诱导的BMSCs和软骨细胞为对照,分析和比较不同诱导时间对BMSCs体外成软骨分化的影响。结果体外诱导4周的BMSCs-PGA/PLA复合物的组织学结构明显较只诱导1周的致密,软骨特异性基质(如蛋白多糖、Ⅱ型胶原等)表达水平明显高于诱导1周的。结论体外诱导时间对BMSCs软骨定向分化具有重要影响,延长诱导时间可明显促进复合物成熟并增加其软骨基质分泌。

成骨微环境仿生支架用于骨组织工程的可行性分析

目的探索使用羟基磷灰石(HA)、脱钙骨基质(DBM)粉末及明胶(GT)制备成骨微环境仿生支架的可行性及其细胞相容性和成骨诱导活性。方法将骨组织粉碎后经脱脂、脱钙、脱细胞处理,并使用DNA定量检测DBM脱细胞效果,再将DBM粉末与一定比例羟基磷灰石及明胶一同制备成为成骨微环境仿生支架。比较不同浓度比例的HA-DBM-GT支架的孔径、孔隙率。取羊骨髓基质干细胞,接种于合适浓度比例的HA-DBM-GT支架,体外培养,于第1、3、7天进行大体、电镜观察,DNA定量及活死细胞染色;于第1、7、14天进行成骨分化相关基因检测。结果DNA定量显示脱钙骨基质粉末的制备过程可有效去除骨组织中的细胞;随着脱钙骨及羟基磷灰石比例的提高,支架孔径明显增大;各组HA-DBM-GT支架孔隙率均可达到84%以上;活死细胞染色及DNA定量证实细胞可在支架上黏附、增殖;qt-PCR检测证实支架材料可诱导干细胞特异性表达成骨基因。结论成功制备了一种成骨微环境仿生支架,并证实其具有良好的材料表征、细胞相容性及成骨诱导活性,可用于组织工程骨构建。

基于三维打印和组织工程技术构建人阴茎形态软骨支撑体

目的探讨基于三维打印和组织工程技术构建人阴茎形态软骨支撑体的可行性。方法应用三维打印技术制备人阴茎形态聚己内酯/羟基磷灰石(PCL/HA)内核,并在外层包被聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)细胞支架,组装成人阴茎形态三维复合支架。获取乳猪关节软骨细胞,培养、扩增至第1代,收取细胞,接种至复合支架,体外培养4周后植入裸鼠皮下,体内8周后取材,进行大体及组织学观察。结果人阴茎形态复合支架形态逼真,植入裸鼠体内8周后,再生出人阴茎形态的软骨支撑体,支撑体表面形成均质、成熟的软骨层,软骨层与内核支架融合良好。结论基于三维打印和组织工程技术,可形成内核为PCL/HA支架,外层包被成熟软骨的人阴茎形态软骨支撑体。

软骨脱细胞基质仿生支架体外构建组织工程软骨

目的探索软骨脱细胞基质(ACM)仿生支架体外构建组织工程软骨的可行性。方法将软骨组织彻底粉碎后脱细胞处理,复合一定比例的明胶(GT)制备三维多孔支架。分析比较不同ACM/GT比例多孔支架的孔径、孔隙率、生物力学和降解速率,选取最适宜软骨体外再生的一组多孔支架用于体外构建。获取、培养猪关节软骨细胞,接种于ACM多孔支架上,体外培养8周后,行大体观察及组织学检测。结果ACM多孔支架孔隙分布均匀,随ACM含量的增加,孔径和孔隙率逐渐增大,力学强度逐渐降低,其中,ACM:GT=5:5组在孔径和孔隙率方面均适宜体外软骨再生。大体观察和组织学检测显示,ACM支架可体外再生均质、典型的软骨组织。结论ACM可制成适宜软骨再生的三维多孔支架,并可体外构建组织工程软骨。

软骨形态发生蛋白1诱导犬真皮成纤维细胞向软骨细胞表型分化的实验研究

目的探讨软骨形态发生蛋白1(Cartilage-derived morphogenetic protein-1,CDMP1)诱导体外培养的犬真皮成纤维细胞(Dermal fibroblasts,DFs)向软骨细胞表型分化的可行性。方法应用CDMP1细胞诱导液对体外扩增至第4代的犬DFs进行诱导培养,观察细胞的形态变化,以免疫荧光染色和RT-PCR检测细胞中软骨特异蛋白的表达情况。结果诱导培养6 d后,实验组部分DFs呈星形或多角形,免疫组化染色显示有软骨特异的II型胶原分泌,RT-PCR检测也表明有Ⅱ型胶原、aggrecan和SOX9表达。但是诱导培养10 d后,均转为阴性。结论 CDMP1可以诱导犬DFs向软骨细胞表型分化,有可能成为组织工程化纤维软骨的种子细胞。

不同代次小鼠脂肪干细胞增殖能力及体外成脂能力的实验研究

目的观察不同代次小鼠脂肪干细胞(mASCs)增殖能力及体外成脂能力,为组织工程种子细胞的合理选用提供实验依据。方法采用胶原酶消化小鼠腹股沟皮下脂肪组织,贴壁培养,体外传代扩增。实验采用原代(P0)、第2代(P2)和第5代(P5)细胞。观察不同代次mASCs的细胞形态及增殖能力;经高密度接种培养4周及成脂诱导2周,通过油红染色、RT-PCR检测,探讨其诱导成脂分化潜能及自发成脂能力。结果小鼠脂肪干细胞经传代后,外观主要呈长梭形及不规则形,不同代次的mASCs均具有很强的体外增殖能力;P0细胞具有极强的体外自发成脂能力,P2细胞自发成脂能力明显降低,至P5时基本没有体外自发成脂能力;P0、P2、P5细胞具有相似的诱导成脂分化潜能。结论随着培养代次的增加,mASCs自发成脂能力降低而诱导成脂分化潜能基本不变,扩增至第5代时仍维持了较强的增殖能力及良好的干细胞特性。在一定范围内mASCs体外传代扩增能明显减少其脂肪前体细胞的含量,有助于间充质干细胞纯化。