人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬

背景:黄韧带骨化发生的病理机制尚不清楚,临床上无有效的药物或非手术治疗的方法。目前研究发现,骨 桥蛋白与自噬在成骨过程中均发挥重要作用,二者在黄韧带骨化中的作用尚不清楚。 目的:通过对骨桥蛋白和自噬在黄韧带骨化发生机制的研究,尝试找出药物治疗的潜在作用靶点。 方法:①黄韧带骨化病、胸椎骨折或单纯腰椎间盘突出症患者行后路全椎板切除减压获取黄韧带,将标本分 为骨化组和非骨化组,每组各取 8 例标本,通过免疫组化染色观察骨桥蛋白、骨钙素及自噬指标 Beclin-1、 LC3、P62 的表达;②通过组织块贴壁法进行黄韧带细胞的分离培养,并用不同质量浓度的骨桥蛋白干预不 同时间来构建体外黄韧带细胞骨化模型;③非骨化组黄韧带细胞用不同浓度的自噬抑制剂 3-甲基腺嘌呤干 预后,再用 100 μg/L 骨桥蛋白诱导,应用 Western blot 检测骨化指标碱性磷酸酶、骨钙素的表达变化;④ 用 100 μg/L 骨桥蛋白干预非骨化黄韧带细胞,并在 0,15,30,60,120 min 终止骨化诱导过程,应用 Western blot 检测 MAPK 信号通路中重要分子 ERK1/2、JNK、P38 的磷酸化情况;⑤非骨化组黄韧带细胞 用 ERK1/2 特异的磷酸化阻滞剂 U0126 阻断 ERK1/2 通路磷酸化后,再用 100 μg/L 骨桥蛋白诱导,应用 Western blot 检测碱性磷酸酶以及骨钙素的表达变化。 结果与结论:①骨化黄韧带和非骨化黄韧带组织骨钙素、骨桥蛋白的免疫组化均呈阳性表达;骨化黄韧带组织 中 Beclin-1 呈阳性表达,而 LC3 及 P62 未见明显阳性结果;非黄韧带骨化组织中 Beclin-1、LC3、P62 均呈 阳性表达;②与非骨化组比较,骨化组黄韧带细胞中碱性磷酸酶和骨钙素的表达增加;骨桥蛋白可诱导黄韧带 骨化,骨桥蛋白的作用具有浓度相关性和时间相关性;③自噬强弱与骨化程度呈负相关,即自噬越明显,骨化 作用越弱;④骨桥蛋白能使 MAPK 信号通路磷酸化,并具有一定的时间相关性;抑制 MAPK 磷酸化过程后, 骨桥蛋白仍然能够诱导黄韧带细胞的骨化;⑤结果表明,黄韧带骨化发生过程中,信号通路上 ERK1/2、骨桥 蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶分子的上下游关系为:ERK1/2→骨桥蛋白→骨钙素/碱性磷酸酶。

改良低温机械物理研磨法制备纳米脱钙骨基质

背景:前期研究证实纳米脱钙骨基质为一种无毒、组织相容性良好、生物利用度高、炎症反应轻、成骨能力强的骨移植替代物,但其制备耗时较长,需多次间断取样行粒度分析,研磨效率低。目的:采用低温物理研磨法制备纳米脱钙骨基质,分析纳米脱钙骨基质的结构特征及制备效率。方法:采用改良Urist法制备同种异体脱钙骨基质,通过二次低温物理研磨法,应用CryoMill全自动冷冻研磨仪先将脱钙骨基质初步研磨至微米级别颗粒,再通过E-Max高能水冷球磨仪进行纳米尺度研磨,最后通过扫描电镜观测研磨效果及材料形貌。结果与结论:采用二次低温物理研磨法制备的纳米脱钙骨基质底层致密,表面充满不规则纳米颗粒,颗粒直径20-50nm,纳米颗粒相互团聚,表面密布纳米级别凹槽,纳米纤维结构间相互连接,内部形成大量相互连通的微米级别孔隙,其微观结构符合纳米生物材料范畴;二次低温物理研磨法仅需25min,提高了研磨效率;结果说明,二次低温物理研磨法制备纳米脱钙骨基质的研磨结果更确切、材料粒度分布均匀性更高。

3D打印技术构建不同比例聚己内酯-磷酸三钙支架及其体外诱导成骨性能

背景:骨组织工程支架的复合材料选择及混合比例对于支架成骨诱导作用的影响巨大。目的:借助3D打印技术构建不同混合比例的聚己内酯-磷酸三钙复合支架,探究其物理特征和成骨诱导能力。方法:将聚己内酯(polycaprolactone,PCL)和磷酸三钙(tricalcium phosphate,TCP)分别按照10∶0、9∶1、8∶2、7∶3的质量比混合,借助3D打印技术构建单纯聚己内酯支架和聚己内酯-磷酸三钙复合支架,分别命名为单纯PCL支架、PCL-10%TCP支架、PCL-20%TCP支架、PCL-30%TCP支架,利用扫描电子显微镜和疲劳试验机表征支架的微观结构和力学性能。将兔骨髓间充质干细胞分别接种于单纯PCL支架、PCL-10%TCP支架、PCL-20%TCP支架上,接种后第1,4,7天检测细胞增殖,第1,7,14天检测细胞内碱性磷酸酶活性,第7,14,21天检测支架上清液内的钙含量。结果与结论:(1)PCL-30%TCP支架无法通过该方式构建支架;(2)与单纯PCL支架相比,PCL-10%TCP支架、PCL-20%TCP支架的抗压强度和弹性模量更强(P<0.05),孔隙率无明显改变;(3)单纯PCL支架、PCL-10%TCP支架、PCL-20%TCP支架均可观察到预先设计的孔隙结构,支架内部孔隙相互连通;(4)单纯PCL支架、PCL-10%TCP支架、PCL-20%TCP支架均可促进骨髓间充质干细胞增殖,PCL-20%TCP支架组接种第4,7天的细胞增殖效果优于其余两组支架(P <0.05);(5)PCL-20%TCP支架组接种第7,14天的细胞内碱性磷酸酶活性高于其余两组支架(P <0.05);(6)接种第14天,PCL-20%TCP支架组钙含量高于其余两组支架(P<0.05);(7)结果表明,相比于其他支架,PCL-20%TCP支架具有更好的力学性能,更能促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。

胸椎黄韧带骨化合并硬膜囊骨化的影像学特征和病理学表现

目的 探讨胸椎黄韧带骨化合并硬膜囊骨化的影像学特征及其病理学表现。方法 回顾性分析采用胸椎椎板-黄韧带骨化物整块切除术治疗的胸椎黄韧带骨化症患者29例(62个节段),男19例,女10例;年龄(54.9±10.25)岁(范围36~77岁)。其中合并硬膜囊骨化11例16个节段,无合并硬膜囊骨化18例46个节段。观察CT骨窗和MRI横断面T2WI的骨化物形状和骨化物与硬脊膜的关系,测量CT骨窗横断面单侧椎管占有率。取2例合并硬膜囊骨化患者术中病理标本行HE染色检查。结果 骨化物形状:合并硬膜囊骨化的16个节段中,CT有7个节段(43.8%)、MRI有2个节段(12.5%)表现为黄韧带硬膜囊侧存在骨化层;CT有1个节段(6.3%)、MRI有2个节段(12.5%)表现为典型的Tram track征。骨化物与硬脊膜的关系:CT有7个节段(43.8%)、MRI有7个节段(43.8%)表现为“C”形征;CT有7个节段(43.8%)、MRI有8个节段(50.0%)表现为“V”形征。合并硬膜囊骨化组单侧骨化物椎管占有率为60.5%±13.0%,无合并硬膜囊骨化组为42.2%±12.3%,两组差异有统计学意义(t=5.192,P<0.001)。合并硬膜囊骨化的16个节段中,有“C”形征表现的7个节段的单侧骨化物椎管占有率为68.8%±12.8%,无“C”形征出现的9个节段的单侧骨化物椎管占有率为54.39%±9.9%,两组差异有统计学意义(t=2.45,P=0.028)。组织学检查可见硬脊膜与骨化物的交界存在两种病理现象:硬脊膜内存在纤维软骨、软骨和成骨的移行区;未骨化硬脊膜与骨化物融合,组织学分界清晰,黄韧带骨化物腹侧硬脊膜萎缩或消失。结论 硬膜囊骨化的发生与黄韧带骨化始于硬膜囊侧和骨化物持续增厚相关,硬膜囊骨化的病理学表现是局部硬脊膜组织骨化或硬脊膜与黄韧带骨化物组织融合。

椎间盘Pfirrmann退变评分对人工颈椎间盘置换术后异位骨化量化的价值

目的探讨椎间盘Pfirrmann退变评分对人工颈椎间盘置换(artificial cervical disc replacement,ACDR)术后异位骨化(heterotopic ossification,HO)量化的价值。方法回顾性分析2009年1月至2016年12月接受ACDR手术并获2年以上随访的120例患者资料,男88例,女32例;年龄(43.86±8.69)岁(范围,27~67岁);单节段置换100例(Hybrid手术9例),双节段置换20例(Hybrid手术3例)。颈椎侧位X线观察HO发生情况,McAfee等级标准评估HO严重度,Pfirrmann评分系统在术前MRI上评估椎间盘退变程度。加权Kappa检验分析Pfirrmann评分系统和McAfee分级系统不同观察者间的评价一致性,t检验比较HO组和非HO组术前椎间盘的Pfirrmann退变评分,卡方检验分析Pfirrmann评分对术后置换节段HO发生率的影响,Spearman秩和检验分析该评分与HO组McAfee等级、术后节段活动度(range of motion,ROM)的相关性。根据不同Pfirrmann评分组的置换节段HO发生率,提出ACDR手术的HO风险量化指标。结果120例患者随访(74.08±28.05)个月(范围,31~125个月)。术后2年根据病例数统计,38例患者颈椎出现HO,发生率为31.67%(38/120),单节段置换、双节段置换手术的HO发生率分别为27%(27/100)和55%(11/20);根据置换节段数统计,HO组和非HO组分别包含46和94个置换节段。术前椎间盘Pfirrmann评分,HO组为(3.17±1.08)分较非HO组[(2.52±0.98)分]高25.80%,差异有统计学意义(t=3.46,P=0.01);置换节段HO发生率随术前Pfirrmann评分升高而显著升高(χ^2=12.44,P=0.01);HO组术前椎间盘Pfirrmann评分与术后置换节段McAfee等级呈显著正相关(R=0.54,P=0.01),与术后ROM呈显著负相关(R=-0.75,P=0.01)。当椎间盘退变Pfirrmann评分<3、=3和>3时,术后2年置换节段HO发生率分别为20.55%(15/73)、38.46%(10/26)和51.22%(21/41)。结论颈椎间盘Pfirrmann退变评分与术后置换节段的HO发生率、McAfee等级以及ROM显著相关;颈椎间盘退变的Pfirrmann评分可作为ACDR手术HO风险的量化指标。