表达SIRPα-Fc的基因-溶瘤腺病毒对胆管癌治疗作用的实验研究

目的:研究表达SIRPα-Fc融合基因的基因-溶瘤腺病毒SG655-SF对胆管癌的治疗作用。方法:将信号调节蛋白α(signal regulatory proteinα,SIRPα)突变体CV1与人Ig G1 Fc段融合(简称SF),构建SF编码序列(基因)。将SF基因插入条件增殖型腺病毒载体SG655,构建基因-溶瘤腺病毒SG655-SF。重组病毒经鉴定正确后,经扩增、滴度测定,感染293细胞。Western blot检测外源基因的表达情况。间接免疫荧光检测293细胞表达的SF蛋白对胆管癌细胞的结合能力。噻唑蓝(MTT)法测定病毒对胆管癌细胞的杀伤作用。建立人类胆管细胞癌裸鼠移植瘤模型,用SG655-SF治疗,观察疗效。取肿瘤组织进行切片检查,验证其抗肿瘤作用。结果:成功构建SF表达框、基因-溶瘤腺病毒SG655-SF。SG655-SF感染293细胞后,能高效表达SF蛋白。293细胞表达的SF蛋白能有效结合CD47高量表达的胆管癌细胞株EH-CA1-T、EHCA1-Y。SG655-SF能有效杀伤胆管癌细胞。SG655-SF可以有效抑制肿瘤在裸鼠体内生长。肿瘤组织切片检查提示有肿瘤坏死和病毒浸润。结论:基因-溶瘤腺病毒SG655-SF具有良好的抗胆管癌活性。

晚期非小细胞肺癌患者DC-CIK治疗前的免疫状态与预后的关系

目的探讨晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞(dendritic cellcytokine induced killers,DC-CIK)治疗前外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞(regulatory T cells,TRegs)、CD3+CD56+细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIKs)、CD4+/CD8+T细胞比值与预后的关系。方法采用流式细胞仪技术检测45例晚期NSCLC患者DC-CIK治疗前、后外周血CD4+CD25+CD127-TRegs、CD3+CD56+CIKs、CD4+和CD8+T细胞,并与患者临床特征进行相关分析;采用Cox回归模型分析治疗前CD4+CD25+CD127-TRegs、CD3+CD56+CIKs、CD4+/CD8+T细胞比值对患者预后的影响。结果晚期NSCLC患者DC-CIK治疗前、后比较,治疗后患者外周血CD4+T细胞减少,CD8+T细胞增多,CD4+/CD8+T细胞比值下降,差异均有统计学意义(均P<0.05);原发病灶瘤体最长直径越大,患者治疗前外周血TRegs越多,CIKs越少(均P<0.05);生存分析显示,治疗前TRegs越多,患者预后越差,生存期越短,且TRegs>7×109/L影响患者的生存(P<0.05)。结论晚期NSCLC患者外周血TRegs是判断预后的独立预测指标。

携带mIFN-γ的溶瘤病毒CNHK300-mIFN-γ对肿瘤细胞的体外杀伤作用

目的:研究携带小鼠干扰素γ(mIFN-γ)基因的溶瘤病毒CNHK300-mIFN-γ(CNHK300-Mγ)对恶性肿瘤细胞的体外杀伤作用。方法:CNHK300-Mγ、CNHK300、ONYX-015和AdEasy-mIFN-γ(AdEasy-Mγ)感染肺癌细胞株A549、肝癌细胞株SMMC-7721、胰腺癌细胞株PANC-1和正常成纤维细胞株BJ,通过病毒增殖实验、细胞病理效应和细胞杀伤实验观察CNHK300-Mγ、CNHK300和ONYX-015在上述肿瘤细胞和正常细胞中的增殖能力和对这些细胞的杀伤作用,通过双抗体夹心ELISA检测CNHK300-Mγ和AdEasy-Mγ在上述肿瘤细胞和正常细胞中不同时相的mIFN-γ表达量。结果:CNHK300-Mγ具有类似于CNHK300的肿瘤细胞选择增殖性,能在恶性肿瘤细胞中大量增殖并杀灭肿瘤细胞,均强于ONYX-015(P<0.01),而在正常细胞中增殖和杀伤作用均较弱,弱于ONYX-015(P<0.05)。CNHK300-Mγ感染恶性肿瘤细胞后有大量的mIFN-γ表达,并随着感染时间延长表达量也相应上升,而AdEasy-Mγ感染后只有少量mIFN-γ的表达,而且感染的时间延长表达量变化也不大(P<0.01)。结论:CNHK300-Mγ能选择性地在肿瘤细胞中增殖,并杀灭肿瘤细胞,同时大量表达具有抗肿瘤作用的蛋白,发挥多重抗瘤作用,有良好的临床应用前景。

DC-CIK细胞免疫治疗肺癌脑转移病例报告一例

1病例资料患者王某,女,67岁,无吸烟史,2008年10月因发现左颈部肿块就诊于当地医院,同时伴咳少量白色泡沫痰、无痰中带血,全身无发热、胸闷、胸痛等不适症状。行胸部CT检查提示左下肺背段占位,伴纵膈、左肺门及左锁骨上窝多发淋巴结肿大。左锁骨上淋巴结穿刺活检病理诊断为转移性低分化腺癌,免疫组化结果考虑来源于肺。

表达人IL-21的细胞因子诱导的杀伤细胞对裸鼠肝癌的治疗研究

目的探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK细胞)作为人IL-21(hIL-21)基因的载体治疗肝癌的可行性。方法构建携带hIL-21、CopGFP基因的质粒pDC759-hIL-21、pDC759-CopGFP并分别与pAd5、pAd5F35共转染HEK293细胞,包装表达hIL-21、CopGFP蛋白的Ad5、Ad5F35病毒。分离培养CIK细胞并绘制生长曲线,将携带CopGFP基因的Ad5、Ad5F35病毒以不同MOI(0、1、5、10、50、100、1 000)感染CIK细胞;将携带hIL-21基因的Ad5、Ad5F35病毒以不同MOI(0、1、5、10、20、50)感染SMMC-7721细胞48h后检测hIL-21蛋白的表达;将携带hIL-21基因的Ad5F35病毒以不同MOI(0、1、5、10、50、100)感染CIK细胞48h后检测hIL-21蛋白的表达。皮下注射SMMC-7721细胞致裸鼠成瘤,以表达hIL-21的CIK细胞治疗荷瘤裸鼠,评价疗效。结果成功构建出用于Ad5、Ad5F35病毒的质粒;构建的质粒与pAd5、pAd5F35脂质体共转染HEK293细胞,包装出表达hIL-21及CopGFP蛋白的Ad5、Ad5F35病毒。携带CopGFP基因的Ad5、Ad5F35病毒对CIK细胞的感染实验表明Ad5F35腺病毒感染率更高;携带hIL-21基因的Ad5、Ad5F35病毒对SMMC-7721细胞的感染实验表明hIL-21表达量差异无统计学意义;携带hIL-21基因的Ad5F35病毒以50MOI感染CIK细胞后hIL-21的表达量较高;动物实验统计分析说明表达hIL-21的CIK细胞对荷瘤裸鼠疗效较好。结论 hIL-21与CIK细胞在荷瘤小鼠体内联合发挥抗肿瘤作用。

腺病毒介导的全抗体基因治疗卵巢癌的实验研究

目的 探讨应用基因治疗方法表达完全抗体的可行性及其对肿瘤的治疗作用。方法构建携带曲妥珠单抗 [Trastuzumab ,商品名 :赫赛汀 (Herceptin) ]全抗体基因的腺病毒载体 ,利用重组技术获得增殖缺陷型腺病毒Ad SG Her ,用Ad SG Her转染人正常肝细胞株L 0 2 ,判断体外肝细胞是否可以表达Herceptin抗体 ;将卵巢癌SK OV 3细胞接种于裸鼠皮下 ,3d后把 4 0只成瘤裸鼠随机分为3个治疗组和 1个对照组 ,每组各 10只。治疗组裸鼠尾静脉分别注射不同滴度的Ad SG Her :治疗A组注射 2× 10 9空斑形成单位 ( pfu) /只 ,B组注射 1× 10 9pfu/只 ,C组注射 5× 10 8pfu/只。用酶联免疫吸附试验 (ELISA)分别在体外转染Ad SG Her后的第 3天和第 7天 ,以及裸鼠接受Ad SG Her治疗后的第 3、7、10、14、2 1、2 8、35天检测Herceptin的表达量 ;通过间接免疫荧光法 (IFA)和Western印迹法分别检测血清中的抗体与Her2过表达卵巢癌细胞株SK OV 3结合的特异性以及所表达全长抗体的完整性 ;同时观察不同滴度的Ad SG Her对荷SK OV 3实体瘤裸鼠的治疗作用。结果 构建的带有全长Herceptin基因的重组腺病毒Ad SG Her ,在体外及体内均能高效表达人源化抗体Herceptin。Western印迹显示

TIL肿瘤过继细胞治疗研究进展

肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)是从肿瘤组织中分离出的CD4+、CD8+T细胞,在体外经白介素2(interleukin-2,IL-2)的刺激、活化、扩增后可应用于临床肿瘤过继细胞治疗(adoptive cell therapy,ACT)。为避免IL-2在扩增中的大量使用使得TIL中CD4+CD25+Treg数量增加所产生的免疫耐受现象,现在研究集中于改进TIL的体外扩增方法;研究显示,"年轻"型TIL(young TIL)靶向肿瘤的特异性更高,故其是潜在的扩增对象。临床使用TIL过继治疗前需对肿瘤患者进行全身放疗处理;TIL过继治疗联合化疗药物(如环磷酰胺,氟达拉滨等)对自体淋巴清除(lymphodepletion)的肿瘤患者疗效显著,将成为以后肿瘤免疫治疗的主要方向;除化疗药物外,还可开发肿瘤疫苗、单克隆抗体等联合TIL过继治疗。本文主要介绍TIL培养体系、功能改进的研究以及TIL过继治疗联合化疗药物在临床恶性肿瘤治疗中的应用,讨论其可能存在的问题并展望未来的发展方向。

腺病毒介导的双荧光素酶报告系统的构建及其应用

目的:构建腺病毒介导的双荧光素酶报告系统,并利用其筛选一种广谱高活性启动子。方法:将待检测启动子控制的萤火虫荧光素酶(Fluc)基因表达框插入腺病毒E1区,CMV启动子控制的海肾荧光素酶(Rluc)基因表达框插入E3区作为内参,构建腺病毒介导的双荧光素酶报告系统。检测不同病毒感染量条件下测得的启动子活性数据差异、组内差异,难转染细胞内的转染情况,分析该系统的操作简便性、稳定可靠性。应用该系统检测常用启动子CAG、CASI及新启动子CCAU在一系列细胞内的活性,从中筛选出一种广谱高活性启动子。结果:成功构建了腺病毒介导的双荧光素酶报告系统;不同MOI值下测得的各启动子相对活性值无显著差异(P>0.05);在所实验的细胞内均能有效且准确地测定各启动子的活性,且复孔间方差小;CCAU在所实验的9株细胞中的表达活性显著(P<0.05)或极显著地(P<0.01)高于CASI以及CAG的表达活性。结论:构建获得的腺病毒介导双荧光素酶报告系统操作简便、稳定可靠、通用性强,可作为启动子活性筛选的一种新方法;利用该系统筛选获得了一种新的广谱高活性启动子CCAU。

术后肝功能指标对肝内胆管癌根治性切除患者预后的影响

目的探讨影响肝内胆管癌术后患者生存的危险因素。方法回顾性分析本院2009年3月至2014年3月收治的行根治性切除术的肝内胆管癌患者的临床资料,选择32种临床和实验室诊断检测相关指标,分析影响肝内胆管癌根治性切除患者术后生存危险因素,采用单因素、多因素Cox模型分析影响肝内胆管癌患者术后生存的危险因素。结果最终入选患者189例,多因素分析表明,肿瘤数目、肿瘤大小、淋巴结转移情况、术前CA19-9水平、术前γ-谷氨酰转移酶、术后第1天血总胆红素及术后第5天血丙氨酸转氨酶是肝内胆管癌根治性切除患者术后生存的独立危险因素(P<0.05)。结论术后第1天总胆红素及术后第5天丙氨酸转氨酶水平对肝内胆管癌根治性切除患者预后有指示作用;术前、术后积极保肝治疗,改善营养状况,术中尽量减少对肝脏的创伤,均有利于改善预后。

诱导多潜能干细胞(iPSCs)的研究与应用进展

诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是体细胞在外源因子作用下,经直接细胞核程序重整而重新获得多潜能的干细胞.iPSCs在疾病的模型建立与机理研究、细胞治疗、药物的发现与评价等方面有着巨大的潜在应用价值.在过去几年中,科学家们致力于改进体细胞重编程技术并取得许多突破.然而,为实现其在临床上的应用,必须克服体细胞重编程效率低和iPSCs成瘤风险两大挑战,而且重编程机制有待进一步阐明.结合iPSCs最新研究成果,评述了有关领域国内外研究进展,重点讨论当前存在问题,并展望未来研究方向.

肝癌患者脂肪干细胞重编程为诱导多潜能干细胞

目的重编程肝癌患者来源的脂肪干细胞为诱导多潜能干细胞。方法包装携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的反转录病毒,将病毒感染脂肪干细胞并培养诱导后的细胞,采用碱性磷酸酶染色、定量PCR和原位免疫荧光实验鉴定诱导的克隆样细胞。结果诱导的克隆样细胞表达碱性磷酸酶,定量PCR证实克隆样细胞表达胚胎干细胞多能性基因,免疫荧光实验证实其表达Oct4和Sox2。结论肝癌患者来源的脂肪干细胞可高效重编程为诱导多潜能干细胞,且脂肪干细胞可作为培养诱导多潜能干细胞的滋养细胞,为提高成体细胞重编程效率和建立基于诱导多潜能干细胞的肝癌模型研究提供了平台。

靶向黏蛋白1嵌合抗原受体修饰的Jurkat T细胞特异杀伤肝癌细胞

目的探讨靶向黏蛋白1(mucin 1,MUC1)的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞株(CAR-T)对MUC1高表达肝癌细胞的特异杀伤能力。方法分别构建第1代与第3代靶向MUC1的CAR基因表达框(MUC1-CAR与G3MUC1-CAR),并将其装入慢病毒载体,利用获得的重组慢病毒感染Jurkat细胞,通过CCK-8法、ELISA法、乳酸脱氢酶释放实验,分别检测在MUC1抗原存在条件下,CAR-T细胞的增殖、IL-2分泌量、杀伤作用。结果成功构建2种靶向MUC1嵌合抗原受体表达框的重组慢病毒Jurkat CAR-T细胞株。两种Jurkat CAR-T细胞均能特异识别MUC1分子,杀伤MUC1高表达的肝癌细胞QGY-7701,而对MUC1低表达的正常肝细胞基本不杀伤;第3代CAR修饰的Jurkat T细胞接触MUC1分子后,其增殖速度、IL-2分泌量和杀伤效率均优于第1代MUC1修饰细胞(P<0.05或P<0.01)。结论靶向MUC1的Jurkat CAR-T细胞能特异杀伤MUC1高表达的肝癌细胞。

重编程肝癌细胞系Huh7为多潜能干细胞样细胞

目的重编程肝癌细胞系Huh7细胞为多潜能干细胞。方法包装携带有Oct4、Sox2、Nanog、Lin28基因的慢病毒,将包装好的病毒共感染Huh7细胞,诱导多潜能干细胞样克隆细胞。采用碱性磷酸酶染色、免疫荧光、实时定量RT-PCR等方法对诱导出的细胞进行鉴定,并采用畸胎瘤实验鉴定细胞的分化潜能。结果 Huh7细胞被重编程为多潜能干细胞样细胞(命名为iHuh7),碱性磷酸酶染色呈阳性,免疫荧光实验证明其表达多潜能因子Oct4和TRA-1-60,实时定量RT-PCR实验证明其高水平表达内源性的多潜能相关基因及干细胞特异的microRNAs,体内分化实验结果表明iHuh7可以形成畸胎瘤。结论通过携带4种多潜能基因Oct4、Sox2、Nanog、Lin28的慢病毒介导的重编程,Huh7细胞可以被诱导为多潜能干细胞样细胞。