重组腺病毒血管内皮生长因子165基因心包腔与冠状动脉转染猪心肌效果比较

目的比较经心包腔与冠状动脉转染重组腺病毒血管内皮生长因子165(Ad-VEGF165)基因的效果。方法20头小型猪随机等分为心包转染组和冠状动脉转染组,2组均采用球囊堵塞前降支第一对角支远端,心包组心肌梗死模型建立后即刻,采用经皮剑突下穿刺中心静脉导管心包腔内转染,胶原酶和透明质酸酶预先处理心包,然后注射Ad-VEGF1651.0ml(2.0×109pfu);冠状动脉组心肌梗死模型建立后即刻,经冠状动脉注射Ad-VEGF1651.0ml(2.0×109pfu),于注射后3d、7d、28d分别测定2组心肌组织内VEGF水平、微血管密度、心功能。结果心包转染组和冠状动脉转染组的心肌组织均表达有VEGF165基因,组织内VEGF水平在7d时达高峰,28d时降至基线水平,心包转染组高于冠状动脉转染组((702±85)ng/Lvs(592±59)ng/L,P=0.026)。2组微血管密度随转染时间增加,心包转染组心功能优于冠状动脉转染组(FS/%32.9±2.2vs30.6±2.1,P=0.049;EF/%72.11±5.20vs65.87±2.16,P=0.034)。结论导管介导的心包腔与冠状动脉转染Ad-VEGF165基因治疗心肌缺血是有效、切实可行的,而前者可能是更有前途的新方法。

经心包腔转染腺病毒血管内皮生长因子165基因对猪冠脉血管形成的影响

目的:探讨以腺病毒为载体的血管内皮生长因子165(Ad VEGF165)基因经心包腔转染的表达规律、合适的剂量及对缺血心肌血管生成的作用。方法:随机将20头中华小型猪分为实验组和对照组,每组10头。采用球囊堵塞前降支第一对角支远端建立心肌梗死模型。构建后即刻,实验组采用经皮剑突下穿刺,中心静脉导管插入心包腔内,以含胶原酶1200u及透明质酸酶3000u的生理盐水2ml预处理心包后,在心包腔内注入含Ad VEGF165基因2.0×109pfu的生理盐水1ml;对照组同样方法预处理心包后,在心包腔内注射生理盐水1ml。注射后3d(n=2)、7d(n=2)及28d(n=6)分别用免疫组化、超声心动图检测缺血心肌血管新生情况及心功能,并以酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测血浆及心肌组织中Ad VEGF165的表达。结果:Ad VEGF165基因经心包腔转染缺血心肌组织后,在心肌组织中呈高表达,于7d达到高峰,28d降至基线水平,血浆中无目的基因的表达;28d时,实验组缺血心肌微血管密度(MVD)、心功能均明显高于对照组(MVD(517.00±75.70)mm-2vs(226.50±54.10)mm-2,P=0.009;LVEF(%)(72.11±5.20)vs(55.14±4.37),P=0.005)。结论:用胶原酶及透明质酸酶预处理心包后,经其转染Ad VEGF165可以诱导急性心肌梗死模型局部VEGF蛋白表达,促进缺血心肌组织血管新生并能改善心功能。

复制缺陷的重组腺病毒经心包腔转染急性心肌梗死猪观察

目的:评价重组腺病毒经心包腔转染的效率及持续时间。方法:应用磷酸钙沉淀方法制备携带大肠杆菌LacZ基因复制缺陷的重组腺病毒(Ad-LacZ)。12头中国小型猪随机等分为实验组和对照组,采用球囊堵塞前降支第一对角支远端,心肌梗死模型建立后即刻采用经皮剑突下穿刺中心静脉导管心包腔内注射转染,28d后处死。实验组胶原酶1200u及透明质酸酶3000u预处理心包后,在心包腔内注射Ad-LacZ基因2.0×109噬斑集落形成单位;对照组:同样方法预处理心包后,在心包腔内注射生理盐水1ml。于注射后3d、7d及28d分别对缺血心肌进行HE、HBFP及X-gal染色。结果:冠状动脉造影证实前降支远端完全闭塞,病理学检查显示心肌有缺血和梗死。实验组注射Ad-LacZ基因后第3d、7d及28d后X-gal染色有阳性细胞,以7d最明显,对照组28d内均未发现阳性细胞。结论:应用球囊堵塞法可成功建立猪急性心肌梗死模型,胶原酶及透明质酸酶预处理心包后,腺病毒载体可转染缺血心肌,并持续表达4周。

心包穿刺简易装置在基因转染中的应用

目的探讨自制心包穿刺装置转染心脏的安全性、可行性。方法应用磷酸钙沉淀方法制备携带大肠杆菌LacZ基因复制缺陷的重组腺病毒(Ad-LacZ),将12头中国小型猪分为实验组和对照组,采用球囊堵塞前降支第一对角支远端,心肌梗死模型建立后即刻,采用自制简易心包腔穿刺装置经皮剑突下穿刺,成功后置中心静脉导管于心包腔内并行转染,28 d后处死。实验组:胶原酶1200 U及透明质酸酶3000 U预处理心包后,在心包腔内注射Ad-LacZ基因2.0×109p.f.u;对照组:同样方法预处理心包后,在心包腔内注射生理盐水1 mL。于注射后3、7及28 d分别对缺血心肌进行染色及病理观察。结果冠状动脉造影证实前降支远端完全闭塞,病理显示心肌有缺血和梗死;实验组注射Ad-LacZ基因后第3、第7天及28d后X-gal染色有阳性细胞,以第7天最明显,对照组无阳性细胞。结论自制的心包腔简易穿刺装置将腺病毒载体转染至缺血心肌是安全的,可行的,并且腺病毒可持续表达4周。

hTERT启动子克隆及其肿瘤细胞特异性的研究

目的:探讨克隆人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子对肿瘤细胞特异性的意义。方法:全基因合成hTERT启动子核心序列TP258,克隆入T载体,构建pUCmT-TP258测序;SalⅠ+BamHⅠ酶切pUCmT-TP258,将其片断插入pGL3-Basic/XhoⅠ+BglⅡ位点,构建pGL3-TP258质粒载体。将pGL3-Basic、pGL3-control和pGL3-TP258转染培养的人结肠癌细胞株(CaCo-2)、人乳腺癌细胞株(MCF-7)、原代肾癌细胞(RCC)和人正常成纤维细胞(UFC、BJ、MRC-5),测定Luciferase活性,计算其相对活性。结果:在端粒酶阳性的肾癌细胞RCC、结肠癌细胞CaCo-2和乳腺癌细胞MCF-7中,TP258启动子相对活性很高,分别为32·40±15·32、37·70±6·38和12.80±7.28;而在正常的UFC、BJ和MRC-5细胞中,TP258活性很低,分别是0.40±0.14、0.26±0.13和0.38±0.05,两组间差异有统计学意义,P=0·0035。结论:hTERT核心启动子TP258在肿瘤细胞中活性明显高于在正常细胞中的活性,具有肿瘤特异性。TP258可以介导基因在肿瘤中的定向表达,实现基因表达的靶向性。