p16抑癌基因定点突变及其在大肠杆菌中的表达与纯化

为了研究错义突变对ｐ１６功能的影响，应用ＰＣＲ体外定点突变方法对ｐ１６ｃＤＮＡ进行体外定点突变，并将野生型和突变型ｐ１６ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＸ－５Ｔ载体，在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定确证表达．而后用谷胱甘肽－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化野生型和突变型ｐ１６融合蛋白．得到了第４８位密码子ＣＣＧ（Ｐｒｏ）→ＣＴＧ（Ｌｅｕ）突变的ｐ１６－Ｐ４８突变体，并在大肠杆菌中表达了４２ｋＤ的ＧＳＴ－ｐ１６和ＧＳＴ－ｐ１６Ｐ４８Ｌ融合蛋白．

P48L和D74N突变对p16基因功能的影响

应用DNA聚合酶链式反应(PCR)技术,对p16抑癌基因(CDKN2)进行体外定点突变,在p16cDNA中引入第48位密码子CCG(Pro)→CTG(Leu)和第74位密码子GAC(Asp)→AAC(Asn)突变,构建了p16-P48L和p16-D74N突变体。野生型和突变型p16 cDNA克隆于pcDNA3构建pCMV-p16、pCMV-p16P48L和pCMV-p16D74N真核表达载体,导入纯合缺失p16基因的人肺癌细胞株H460,经RNA点杂交、RNA印迹和细胞免疫化学染色,检测到P16表达。通过比较表达野生型和突变型P16的H460细胞在~3H-TdR掺入及细胞所在周期的差异,证实P16表达抑制细胞进入S期,而P48L和D74N突变体对细胞进入S期没有什么影响,提示P48L和D74N突变导致P16蛋白功能丧失。

p16基因的原核表达及抗P16抗血清的制备

采用基因重租技术,将野生型p16 cDNA通过中间载体pVL1392最后载入表达载体pGEX-5T,IPTG诱导重组质粒转化的大肠杆菌,蛋白质印迹证实42×10~3的融合蛋白GST-P16的表达。表达了GST-P16的重组菌经加热破菌后行SDS-PAGE,将GST-P16蛋白条带切下后经反复冻融于皮内多点注射免疫家兔。所收获的兔血清经蛋白质印迹法检测到抗P16抗体滴度为1:625。结果表明通过pGEX-5T融合蛋白表达系统能方便地提供制备抗P16抗血清的免疫原,该免疫原未经纯化并未影响抗P16抗血清的产生。

P48L和D74N突变影响P16基因功能

应用PCR技术，对P16抑癌基因（CDKN2）进行体外定点突变．在P16cDNA中引入第48位密码子CCG（Pro）→CTG（Leu）和第74位密码子GAC（Asp）→AAC（Asn）突变，构建了p16－P48L和p16－D74N突变体，并把它们导入纯合缺失P16基因的人肺癌细胞株H460．经RNA点杂交、Northern印迹、Western印迹和细胞免疫化学染色，检测到P16表达．通过比较表达野生型和突变型P16的H460细胞在3H－TdR掺入及细胞所处周期的差异，证实P16表达抑制细胞进入S期，而P48L和D74N突变体对细胞进入S期没有影响．为了确证P48L和D74N突变体丧失抑制细胞增殖的功能是因为与CDK4结合功能下降，将野生型和突变型P16cDNA克隆于酵母表达载体plexA，用酵母双杂交筛选实验研究野生型和突变型p16蛋白与CDK4的结合．结果野生型P16和CDK4在酵母中表达并相互作用．而突变型P16cDNA和CDK4在酵母中相互作用受到影响．说明P48L和D74N突变影响了p16蛋白与CDK4的结合，从而影响了其调控细胞周期的功能．