重组hTRAIL腺病毒载体的构建及其体外抗肿瘤效应的初步观察

目的:利用AdEasy载体系统构建含人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)全长基因的重组腺病毒载体,并初步观察其体外对肿瘤细胞的杀伤作用。方法:利用RTPCR法从人外周血单个核细胞(PBMCs)克隆人TRAIL全长基因。将hTRAIL cDNA克隆入穿梭质粒pAdTrack CMV中,与腺病毒骨架结构pAdEasy1共同转化入大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,重组子经酶切鉴定正确后,用脂质体转染入人胚肾293细胞中,包装获得重组腺病毒颗粒,Westernblot检测TRAIL蛋白的表达。将重组腺病毒颗粒体外感染对TRAIL敏感的3种人肿瘤细胞(淋巴瘤细胞Jurkat、前列腺癌细胞PC3、宫颈癌细胞HeLa)后,进行AnnexinⅤFITC/PI染色流式细胞术检测、细胞基因组的DNA电泳和锥虫蓝染色,以观察TRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用。结果:利用RTPCR法从人PBMCs中扩增出843bp的cDNA片段,测序证实为人TRAIL基因。重组子经酶切鉴定正确,Western印迹证实感染TRAIL腺病毒的293细胞中有TRAIL蛋白的正确表达。将重组腺病毒颗粒体外感染HeLa、PC3和Jurkat细胞,4h后用AnnexinⅤFITC/PI染色,流式细胞术检测AnnexinⅤ+PI-细胞群分别占(41.15±3.12)%、(46.20±4.07)%、(38.56±3.45)%;24h后,抽提Jurkat细胞的基因组进行DNA电泳,出现细胞凋亡时特有的DNA条带;36h后用锥虫蓝对HeLa、PC3、Jurkat细胞染色,细胞死亡率分别为(75±5)%、(82±7)%、(70±5)%。结论:成功构建了hTRAIL腺病毒载体,体外感染HeLa、PC3、Jurkat肿瘤细胞后,能通过诱导细胞的凋亡而杀伤肿瘤细胞;为下一步的基因治疗和基础研究打下了基础。