高密度培养大肠杆菌TB1/pMAL-hOCIFm的优化条件

利用Bioengeering3.7L自控式发酵罐,以分批培养和补料分批培养相结合的培养技术,高密度培养重组大肠杆菌TB1/pMAL-hOCIFm,生产重组人破骨细胞形成抑制因子成熟肽(recombinanthumanosteoclastogenesisinhibitoryfactormaturepeptide,rhOCIFm)。通过对碳、氮源补加方式以及溶解氧等参数的控制,使工程菌E.coliTB1/pMAL-hOCIFm的发酵菌体OD600达到57.8,rhOCIFm与MBP融合蛋白(hOCIFm-MBP)的含量达到3.2g/L。本研究为工业化生产rhOCIFm奠定了基础。

吲哚胺2,3双加氧酶基因修饰的DCs对同种异基因T细胞增殖反应的抑制

目的探讨吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine2,3dioxygenase,IDO)基因修饰的树突状细胞(dendriticcells,DCs)在体外对造血干细胞移植物中异基因T细胞增殖反应的抑制作用。方法用携带IDO基因的重组腺病毒转染BALB/c小鼠(受体)骨髓来源的DCs,用RT-PCR法检测DCs表面IDO的表达,用流式细胞术分析IDO基因修饰前后DC表型的变化,并把IDO-DC与C57BL/6小鼠(供体)脾脏来源的T淋巴细胞共培养,通过混合淋巴细胞培养等方法检测异基因T细胞的特异性反应性和诱导T细胞凋亡的情况。结果用腺病毒载体携带的IDO基因转染DCs后,DCs可有效表达IDO,且没有影响DC的表型;IDO基因修饰的DCs可抑制异基因T细胞的增殖反应,同时可诱导异基因反应性T淋巴细胞的凋亡。结论在体外,IDO基因修饰的DCs可抑制移植物中异基因T淋巴细胞的增值反应。移植用该种方法处理过的骨髓,可能会预防移植物抗宿主病(GVHD)的发生。

Mac-1在细胞内走向的直视研究

分别构建荧光蛋白(FP,fluorescenceprotein)与Mac-1的两个亚基(CD11b,CD18)融合蛋白表达载体,并在鉴定pYFP-CD18和pCD11b-BFP共转染的CHO细胞(CHO-Mac-1-FP)表达的Mac-1-FP(Mac-1fusedwithfluorescenceprotein)具有与正常白细胞表达的野生型Mac-1基本一致的结构与功能的基础上,结合应用PE标记的CD11b单抗,通过激光共聚焦显微镜观测CD11b,CD18在PMA刺激和ICAM-1结合后于胞内的走向与归宿.结果显示:(ⅰ)在静态的细胞膜上看不到Mac-1,PMA活化后1h,胞膜上可见CD11b-PE和YFP-CD18群集,2h后内吞,内吞后YFP-CD18的荧光减弱,提示Mac-1有部分降解;24h后PMA再次活化,部分CD11b-PE与YFP-CD18可再次出现在膜上,说明Mac-1还可以被循环利用.(ⅱ)ICAM-1包被磁珠与Mac-1-FP-CHO细胞作用后,4h内粘附增加,同时伴有Mac-1-FP的群集,8h后粘附减少,同时伴有Mac-1-FP的荧光逐渐减弱,这一过程与PMA活化后Mac-1-FP的变化过程类似,提示ICAM-1作用后也可能出现内吞并降解.由以上结果可以得出结论,Mac-1活化后的走向是由胞浆内转位到质膜上,然后内吞,内吞后被降解或可被再利用,与此同时粘附活性亦发生相应的变化,提示受体介导性内吞是白细胞粘附活性降低的重要机制之一.